牛鑫 馮九海 席亞麗 宋利茹 梁倩倩 單華佳 陳艷霞 柯善文 柴倩囡 魏生龍

摘要：毛頭鬼傘培養(yǎng)液具有較強(qiáng)的漆酶活性，漆酶在基質(zhì)中木質(zhì)素的降解和子實(shí)體的發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。目前，人們已經(jīng)完成毛頭鬼傘基因組的測(cè)序，且數(shù)據(jù)已經(jīng)釋放至公共數(shù)據(jù)庫(kù)中，但并未注釋。為了掌握毛頭鬼傘中漆酶的基因數(shù)量及其特征，基于已報(bào)道的毛頭鬼傘漆酶蛋白的氨基酸序列，通過(guò)同源預(yù)測(cè)的方法從其基因組上預(yù)測(cè)獲得21個(gè)漆酶基因，并采用ProtParam、SignalP 5.0、Sompa、TMHMM 2.0、SWISS-MODEL和WoLF PSORT等生物信息學(xué)工具對(duì)其中20個(gè)相應(yīng)漆酶蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析其基本理化特性、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位等。研究結(jié)果可為毛頭鬼傘漆酶基因的克隆及分子作用機(jī)制等研究提供參考。

關(guān)鍵詞：毛頭鬼傘;基因預(yù)測(cè);生物信息學(xué);序列分析;三維結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)： S188文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）05-0067-08

漆酶（laccase，E.C.1.10.3.2）也稱對(duì)苯二酚氧化還原酶，能對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行單電子氧化，利用氧作為最終的電子受體，生成水作為唯一副產(chǎn)品。漆酶主要參與生物合成、木質(zhì)素降解、形態(tài)發(fā)生及色素的生物合成等過(guò)程[1]。漆酶廣泛存在于植物[2]、真菌[3]、細(xì)菌[4]和昆蟲[5]中，真菌漆酶參與黑色素的產(chǎn)生、子實(shí)體的形成及植物發(fā)病機(jī)制[11]等生理過(guò)程。白腐真菌中的擔(dān)子菌以其對(duì)木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的高效分解及轉(zhuǎn)化為二氧化碳的能力而聞名[12]，而且白腐真菌產(chǎn)生的漆酶具有較高的電勢(shì)，比細(xì)菌或植物來(lái)源的漆酶有更高的氧化還原能力[13]。因此，關(guān)于擔(dān)子菌中真菌漆酶的研究較廣泛，目前已有100種以上的真菌漆酶被分離純化[14]。大多數(shù)木腐型真菌都能產(chǎn)生至少1種漆酶同工酶，漆酶是土壤中降解木質(zhì)素的主要酶類[15]。漆酶僅需分子氧催化的特性使得它們作為一種生態(tài)友好、多功能的生物催化劑被廣泛應(yīng)用于外源化合物的轉(zhuǎn)化或固定中。

毛頭鬼傘（Coprinus comatus）俗稱“雞腿菇”，根據(jù)最新分類系統(tǒng)，其屬于擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）鬼傘屬（Coprinus）。毛頭鬼傘是一種食藥兩用菌，素有菌中“新秀”的美譽(yù)，具有較高的商業(yè)潛力。毛頭鬼傘具有很強(qiáng)的產(chǎn)漆酶能力[19]，目前已有4種漆酶蛋白被分離鑒定與克隆，但是關(guān)于毛頭鬼傘漆酶基因的研究較少。Kim等通過(guò)離子交換色譜和制備凝膠電泳分離純化得到毛頭鬼傘分泌到培養(yǎng)基中的一種漆酶，其分子量為67 ku[22]。Bao等從毛頭鬼傘中克隆了2個(gè)新的漆酶基因，其氨基酸序列具有66.12%的同源性[21]。Zhao等采用離子交換層析法、快速蛋白液相色譜法和快速凝膠層析法從毛頭鬼傘發(fā)酵菌絲體中分離純化了1種分子量為64 ku的漆酶，其N端氨基酸序列為AIGPVADLKV，是一種抗致病蛋白，能有效抑制腫瘤細(xì)胞株HepG2、MCF7的增殖，并能抑制人類免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus 1，簡(jiǎn)稱HIV-1）逆轉(zhuǎn)錄酶活性[23]。近期，研究者完成了毛頭鬼傘基因組的測(cè)序，且基因組數(shù)據(jù)已釋放至美國(guó)生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡(jiǎn)稱NCBI）[24]。本研究基于此基因組數(shù)據(jù)對(duì)毛頭鬼傘基因組上所有的漆酶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并對(duì)相應(yīng)漆酶蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 毛頭鬼傘漆酶基因的預(yù)測(cè)

以已報(bào)道的毛頭鬼傘漆酶的蛋白序列（登錄號(hào)為CDJ79885.1）對(duì)毛頭鬼傘組裝基因組數(shù)據(jù)庫(kù)ASM331602v1（登錄號(hào)為GCA_003316025.1）進(jìn)行tblastn比對(duì)，設(shè)置期望值（E值）小于10-3，分別將比對(duì)得到的核酸片段往5′、3′端延伸2 000 bp，將相應(yīng)序列以fasta格式文件復(fù)制、粘貼至Augustus基因預(yù)測(cè)工具（http：//bioinf.uni-greifswald.de/augustus/submission. php）上進(jìn)行在線分析，物種選擇真菌中的雙色蠟?zāi)ⅲ↙accaria bicolor），然后用默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行Augustus。若有多個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果，則選擇第1個(gè)，通過(guò)對(duì)其相應(yīng)蛋白序列進(jìn)行blastP比對(duì)驗(yàn)證，將與漆酶蛋白具有較高相似度的結(jié)果確定為毛頭鬼傘漆酶基因。

1.2 毛頭鬼傘漆酶蛋白的生物信息學(xué)分析工具

分別使用瑞士生物信息學(xué)研究所的專業(yè)蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)（ExPASy）中的ProtParam、SignalP-5.0、TMHMM 2.0、Sompa和SWISS-MODEL等工具對(duì)毛頭鬼傘漆酶的基本理化性質(zhì)、蛋白信號(hào)肽及其剪切位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位、蛋白跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析（表1）。用WoLF PSORT分析毛頭鬼傘漆酶的亞細(xì)胞定位，用MEME進(jìn)行基序分析，用MEGA7軟件中的Clustal W對(duì)毛頭鬼傘漆酶蛋白氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，采用最大似然 （maximum likelihood，簡(jiǎn)稱ML）法建樹(shù)，選擇自舉法（bootstrap method）檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)生情況，自舉重復(fù)次數(shù)設(shè)為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛頭鬼傘漆酶基因的預(yù)測(cè)

由表2可知，毛頭鬼傘基因組上含有21個(gè)可能的漆酶基因，分布在12個(gè)基因座上，經(jīng)blastP比對(duì)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，其中18個(gè)為漆酶基因，而cc_lac18、cc_lac19和cc_lac20等3個(gè)基因則為鐵轉(zhuǎn)運(yùn)多銅氧化酶（類漆酶）基因。在QFED01000161.1基因座上有7個(gè)漆酶基因。cc_lac3、cc_lac8、cc_lac12和cc_lac13基因與已報(bào)道的毛頭鬼傘漆酶基因基本一致，分別對(duì)應(yīng)NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為CDJ79885.1、CDJ79884.1、AFD97050.1和AFD97049.1的漆酶基因。cc_lac21因參考基因組序列QFED01000161.1：51684～51920之間存在缺口，其蛋白序列不能確定。此外，cc_lac16因其5′端測(cè)序不完整，因此在相應(yīng)預(yù)測(cè)蛋白N端有部分缺失。cc_lac 18基因的編碼序列最長(zhǎng)，為2 331 bp;cc_lac20基因的編碼序列最短，僅為724 bp。

2.2 毛頭鬼傘漆酶蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 毛頭鬼傘漆酶的基本理化性質(zhì) 對(duì)表2中Cc_lac 1到Cc_lac 20等20個(gè)（類）漆酶蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。由表3可以看出，這些漆酶的理論分子量為20～86 ku，其中Cc_Lac 20的分子量最小，僅為20.8 ku，Cc_Lac 18的分子量最大，為 85.9 ku;大部分毛頭鬼傘漆酶的等電點(diǎn)（pI）為5～6，Cc_Lac 1、Cc_Lac 18的pI大于7，Cc_Lac 18的pI最高，為9.17;Cc_Lac 11、Cc_Lac 12、Cc_Lac 20的pI小于5，Cc_Lac 12的pI最低，為4.58。Cc_Lac 2、Cc_Lac 5、Cc_Lac 11、Cc_Lac 13、Cc_Lac 15、Cc_Lac 17和Cc_Lac 18的不穩(wěn)定指數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白，其余均為穩(wěn)定蛋白。這些漆酶的脂肪族指數(shù)大多在80～90之間，Cc_Lac 2的值最高，為95.57。

2.2.2 毛頭鬼傘漆酶的信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜結(jié)構(gòu)分析 由表4可以看出，除Cc_Lac 1、Cc_Lac 7、Cc_Lac 14、Cc_Lac 15、Cc_Lac 17和Cc_Lac 18不含信號(hào)肽外，其余漆酶均含有信號(hào)肽。采用WoLF PSORT進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，Cc_Lac 1、Cc_Lac 2為胞質(zhì)蛋白，Cc_Lac 18位于線粒體上，Cc_Lac 16因N端序列缺失而不能確定其亞細(xì)胞定位，其余漆酶均為胞外蛋白。毛頭鬼傘漆酶含有5.8%～29.3%α-螺旋、17%～32%延伸鏈、5%～9%β-轉(zhuǎn)角、44%～56%以上的無(wú)規(guī)則卷曲。Cc_Lac 1 的α-螺旋占比最低（5.8%），Cc_Lac 18 的α-螺旋占比最高（29.3%），Cc_Lac 18的延伸鏈占比最低（17.27%），Cc_Lac 1的延伸鏈占比最高（32.02%）;Cc_Lac 19的β-轉(zhuǎn)角占比最低（5.35%），Cc_Lac 18的β-轉(zhuǎn)角占比最高（902%）;Cc_Lac 20的無(wú)規(guī)則卷曲占比最低（4444%），Cc_Lac 7的無(wú)規(guī)則卷曲占比最高（5607%）。使用Sompa對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果表明，僅Cc_Lac 5、Cc_Lac 8、Cc_Lac 12、Cc_Lac 13和Cc_Lac 18含有1個(gè)跨膜區(qū)域。

2.2.3 毛頭鬼傘漆酶蛋白的多序列比對(duì)分析 去除序列長(zhǎng)度差異較大和相似度低的序列（Cc_Lac 1、Cc_Lac 2及Cc_Lac 16～Cc_Lac 20），對(duì)剩余毛頭鬼傘漆酶序列采用Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)（圖1），可以看出，這些毛頭鬼傘漆酶具有較高的相似度，包含完整的漆酶保守結(jié)構(gòu)域，至少含有81個(gè)保守氨基酸殘基，其中包含可能參與肽鏈間二硫橋形成的4個(gè)半胱氨酸殘基，還包括4個(gè)參與Cu2+結(jié)合的“H-W/S/L/C-H”組氨酸保守位點(diǎn)，此外還具有PDGF、PGPLI、QCPI、QYCDGLRG、DWYH、LING、GKRYRFR、NYWIR、ILRY、RRDV、TDNPGPW等11個(gè)保守區(qū)域。

2.2.4 毛頭鬼傘漆酶蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用Swiss-Model對(duì)毛頭鬼傘漆酶蛋白進(jìn)行同源建模。由圖2可以看出，所有毛頭鬼傘漆酶均為單體，其中Cc_Lac 13含有4個(gè)Cu2+配體，Cc_Lac 4、Cc_Lac 10均含有3個(gè)Cu2+配體和1個(gè)氧分子配體，Cc_Lac 6含有3個(gè)Cu2+配體、1個(gè)N-乙酰葡萄糖胺配體，Cc_Lac 3、Cc_Lac 5、Cc_Lac 8、Cc_Lac 9、Cc_Lac 11、Cc_Lac 12、Cc_Lac 15含有3個(gè)Cu2+配體，Cc_Lac 1含有2個(gè)Cu2+配體，Cc_Lac 7僅含有1個(gè)Cu2+配體，Cc_Lac 18僅含有1個(gè)Cu+配體，Cc_Lac 2、Cc_Lac 14、Cc_Lac 16、Cc_Lac 17、Cc_Lac 19和Cc_Lac 20的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)中不含有配體。此外，Cc_Lac 3、Cc_Lac 6、Cc_Lac 8、Cc_Lac 9、Cc_Lac 13和Cc_Lac 14的三維結(jié)構(gòu)較為相似，Cc_Lac 2、Cc_Lac 4和Cc_Lac 5的三維結(jié)構(gòu)以及Cc_Lac 11與Cc_Lac 15、Cc_Lac 13與Cc_Lac 14的三維結(jié)構(gòu)也較為相似，結(jié)構(gòu)較為相似的還有Cc_Lac 19與Cc_Lac 20，其他毛頭鬼傘漆酶的三維結(jié)構(gòu)差異較大。

2.2.5 毛頭鬼傘漆酶蛋白序列的基序分析和進(jìn)化分析 使用MEME工具對(duì)毛頭鬼傘漆酶蛋白序列進(jìn)行基序（motif）查找，設(shè)置查找數(shù)為3，其余參數(shù)為默認(rèn)值。如圖3-A所示，Cc_Lac 1、Cc_Lac 2 和Cc_Lac 18不含有基序，Cc_Lac 16僅含有motif 2這1個(gè)基序，而Cc_Lac 9、Cc_Lac 14含有motif 1、motif 2

這2個(gè)基序，Cc_Lac 20含有motif 1、motif 3這2個(gè)基序，其他漆酶均含有motif 1、motif 2、motif 3這3個(gè)基序。

利用MEGA7構(gòu)建的毛頭鬼傘漆酶系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3-B），可以看出，Cc_Lac 17、Cc_Lac 18及Cc_Lac 19、Cc_Lac 20與其他漆酶的相似度較低，大體可以分為7組，其中Cc_Lac 1、Cc_Lac 2、Cc_Lac 3、Cc_Lac 5、Cc_Lac 8、Cc_Lac 9為第1組，Cc_Lac 4、Cc_Lac 6、Cc_Lac 7、Cc_Lac 12和Cc_Lac 13為第2組，Cc_Lac 10、Cc_Lac 11、Cc_Lac 15為第3組，Cc_Lac 14、Cc_Lac 16為第4組，Cc_Lac 19、Cc_Lac 20為第5組，Cc_Lac 17、Cc_Lac 18各自為1組。

采用極大似然法和基于JTT矩陣模型推測(cè)毛頭鬼傘漆酶蛋白序列的演化歷史，顯示了具有最高對(duì)數(shù)似然值（-15 105.09）的樹(shù)，相關(guān)類群聚集在一起的樹(shù)的百分比顯示在樹(shù)枝旁邊。將鄰聯(lián)和BioNJ算法應(yīng)用于JTT模型估計(jì)的兩兩距離矩陣，自動(dòng)獲得啟發(fā)式搜索的初始樹(shù)，然后選擇對(duì)數(shù)似然值較高的拓?fù)?。?shù)按比例繪制，分枝長(zhǎng)度以每個(gè)位置替換的數(shù)量來(lái)衡量。

3 討論與結(jié)論

本研究采用已報(bào)道的毛頭鬼傘漆酶蛋白的氨基酸序列，通過(guò)同源預(yù)測(cè)tblastn毛頭鬼傘基因，結(jié)合基因預(yù)測(cè)工具Augustus及blastP對(duì)比驗(yàn)證的方法，從而挖掘到21個(gè)毛頭鬼傘的漆酶基因。盡管目前已經(jīng)有越來(lái)越多的基因組數(shù)據(jù)釋放至公共數(shù)據(jù)庫(kù)，但是絕大部分基因組數(shù)據(jù)僅僅是1個(gè)“草圖”結(jié)果，缺少注釋信息。因此，如何從海量基因組數(shù)據(jù)中挖掘感興趣的基因信息使得生物信息學(xué)方法愈加重要。通過(guò)生物信息學(xué)方法可以較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)基因組上功能基因、轉(zhuǎn)錄因子等信息元件。毛頭鬼傘MG80基因組的大小為30.6 Mbp，為輪廓測(cè)序，基因組上存在很多缺口，組裝質(zhì)量較差，其重疊群（contig） N50僅為17 206 bp[24]，而灰蓋擬鬼傘（Coprinopsis cinerea）作為模式真菌，其基因組為代表性基因組，測(cè)序質(zhì)量高，屬于重疊群組裝，實(shí)現(xiàn)了染色體測(cè)序水平[25]，其contig N50為 3 468 139 bp，明顯大于毛頭鬼傘。因此，在本研究預(yù)測(cè)結(jié)果中，由于 Cc_Lac 21序列中間有大量不確定的堿基信息，不能確定其氨基酸序列，因而不能進(jìn)行預(yù)測(cè)。此外，由于 Cc_Lac 16的5′端存在缺口，因此其部分N端序列缺失，不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)其是否有信號(hào)肽及其剪切位點(diǎn)。由此可見(jiàn)，測(cè)序質(zhì)量較高，即scaffold N50或者contig N50大的基因組通過(guò)生物信息學(xué)能得到更為準(zhǔn)確完整的預(yù)測(cè)信息。將N端氨基酸序列與本研究的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)可知，Zhao等分離純化到的抗致病性漆酶蛋白[23]對(duì)應(yīng)本研究預(yù)測(cè)的Cc_Lac 12。Bao等從毛頭鬼傘中克隆了2個(gè)漆酶基因lac1和lac2[21]，經(jīng)通常比對(duì)分析可知，其對(duì)應(yīng)本研究中Cc_Lac 12和Cc_Lac 13的編碼基因。本研究中毛頭鬼傘漆酶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果有多個(gè)，選取第1個(gè)數(shù)據(jù)用于本研究的分析，Augustus中Cc_Lac 13的第2個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果與該Lac2的結(jié)果一致，第1個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果在N端多出了9個(gè)氨基酸（—MGESHPLAT—）。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，本研究中預(yù)測(cè)得到的Cc_Lac 7與數(shù)據(jù)庫(kù)中毛頭鬼傘類漆酶（部分序列）（登錄號(hào)為ABS10994.1）高度匹配，僅有1個(gè)氨基酸的差異，本研究中預(yù)測(cè)得到的Cc_lac 13則與數(shù)據(jù)庫(kù)中毛頭鬼傘類漆酶（部分序列）（登錄號(hào)為ABS10993.1）一致。

絕大多數(shù)白腐擔(dān)子菌的漆酶都是分泌到胞外的，本研究中毛頭鬼傘有6個(gè)漆酶不帶有信號(hào)肽，通過(guò)分析可知，已報(bào)道分離純化的毛頭鬼傘漆酶均為穩(wěn)定性蛋白，穩(wěn)定性蛋白不易降解，方便分離純化操作。盡管本研究未進(jìn)行糖基化預(yù)測(cè)，但是真菌漆酶大多經(jīng)過(guò)糖基化修飾[14]，Zhao等分離得到的抗致病漆酶蛋白分子量為64 ku[23]，然而本研究預(yù)測(cè)其分子量?jī)H為55 ku。由此可以推測(cè)，Cc_Lac 7含有糖基化修飾。毛頭鬼傘漆酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主，其無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的比例大多在50%以上，玉米大斑病菌漆酶Stlac2的二級(jí)結(jié)構(gòu)也以無(wú)規(guī)則卷曲為主[26]。Kameshwar等對(duì)白腐菌、褐腐菌和軟腐真菌漆酶的理化、結(jié)構(gòu)和功能特性進(jìn)行了廣泛的生物信息學(xué)比較和分析，發(fā)現(xiàn)軟腐菌漆酶較褐腐菌漆酶和白腐菌漆酶有更高比例的無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，說(shuō)明其結(jié)構(gòu)的變異程度也較高[27]。大多數(shù)漆酶由500個(gè)左右氨基酸組成，具有3杯蛋白狀結(jié)構(gòu)域，活性中心含有4個(gè)銅原子，在底物催化過(guò)程中起著轉(zhuǎn)移電子的作用[14]。只有真菌能夠產(chǎn)生2個(gè)結(jié)構(gòu)域和3個(gè)結(jié)構(gòu)域的漆酶，真核生物中大多數(shù)漆酶是由多個(gè)基因編碼的，這是因?yàn)樾枰罅炕虍a(chǎn)物或特定同工酶的催化亞功能化[1]。盡管真菌、細(xì)菌漆酶具有低氨基酸序列同源性，但是它們的分子結(jié)構(gòu)相似，其活性位點(diǎn)的整體幾何結(jié)構(gòu)高度保守。細(xì)菌漆酶有3個(gè)順序排列的杯蛋白狀結(jié)構(gòu)域，銅配體依次為4個(gè)保守基序（HXHG、HXH、HXXHXH和HCHXXXHXXXXM/L/F）。本研究獲得的漆酶基因是按照雙色蠟?zāi)⒌幕蚣艚臃绞筋A(yù)測(cè)的，雖然準(zhǔn)確的基因信息仍需通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證獲得，但是本研究可以簡(jiǎn)化克隆基因的步驟，省去簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)、復(fù)雜的染色體步移和巢式PCR等步驟，可參考預(yù)測(cè)基因序列直接設(shè)計(jì)特異性引物來(lái)獲得目的基因。

致謝：感謝昆明理工大學(xué)相關(guān)工作者對(duì)毛頭鬼傘M80基因組數(shù)據(jù)的公開(kāi)。

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