王 偉，陳淵戈，遲 海*，陶樂仁

（1 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所 上海200090 2 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海200093）

食源性致病菌的污染和增殖是嚴(yán)重威脅食品安全和公共健康的因素之一，成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題[1-2]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，世界上每年有近十分之一的人因食品污染而患病，近42 萬(wàn)人死于食源性疾病[3]。食品添加劑作為延長(zhǎng)食品貨架期的一種手段，可以抑制食源性致病菌的生長(zhǎng)，然而食品添加劑潛在危害及添加劑量成為消費(fèi)者擔(dān)憂的問題[4]。同時(shí)，抗生素作為主要抑制食源性疾病的源頭藥物，其長(zhǎng)期濫用導(dǎo)致食源性致病菌的耐藥性問題愈發(fā)嚴(yán)重[5]。鑒于此，研究人員不斷尋找天然的防腐劑以及不易產(chǎn)生耐藥性的天然抗菌物質(zhì)作為食品添加劑及抗生素的替代品。

細(xì)菌素是細(xì)菌核糖體內(nèi)合成的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質(zhì)，主要對(duì)親緣關(guān)系較近的微生物有一定的抑制作用[6]。細(xì)菌素具有高效、無(wú)毒、穩(wěn)定性強(qiáng)、無(wú)殘留以及不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，被普遍認(rèn)為是抗生素及化學(xué)添加劑的替代物之一[7-8]。目前真正用于商業(yè)化的乳酸菌細(xì)菌素僅有乳酸鏈球菌素（nisin）和片球菌素（pediocin PA-1）[9]。造成這種現(xiàn)象的原因主要是乳酸菌細(xì)菌素的性質(zhì)（如有些乳酸菌細(xì)菌素抑菌譜窄、pH 敏感性及熱穩(wěn)定性差）和分離純化方法等諸多因素限制了乳酸菌細(xì)菌素的獲取及其工業(yè)化生產(chǎn)[10-11]。篩選具有廣譜抑菌作用，pH 耐受范圍廣，熱穩(wěn)定性好的新型細(xì)菌素對(duì)食品安全具有重要意義。

芽孢桿菌（Bacillus sp.）作為動(dòng)植物和微生態(tài)的優(yōu)勢(shì)菌，不僅種類繁多、穩(wěn)定性強(qiáng)，而且廣泛存在于自然界中[12-13]。由芽孢桿菌中地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans）等產(chǎn)生的細(xì)菌素也逐步被關(guān)注和發(fā)現(xiàn)[14-21]。本研究從福建霞浦海域的牡蠣中分離出不同的細(xì)菌，并以常見的食源性致病菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）等為指示菌，系統(tǒng)篩選具有廣譜抑菌作用的產(chǎn)細(xì)菌素的細(xì)菌。其中分離出具有廣譜抑菌活性的14 株細(xì)菌經(jīng)16s rDNA 基因鑒定為芽孢桿菌。這些芽孢桿菌所產(chǎn)的細(xì)菌素主要是由核糖體合成，并具有熱穩(wěn)定性和酶敏感性等特點(diǎn)。結(jié)合Tricine-SDS-PAGE 電泳試驗(yàn)結(jié)果及LC-MS/MS鑒定，潛在細(xì)菌素的分子質(zhì)量范圍及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列均顯示上述廣譜細(xì)菌素可能未被發(fā)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)的新型廣譜細(xì)菌素期望為細(xì)菌素的開發(fā)利用及其在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

牡蠣產(chǎn)自福建霞浦海域，樣品放置于-18 ℃運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備與試劑

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)備 低溫恒溫培養(yǎng)箱 （MIR-153），日本三洋（SANYO）電機(jī)公司；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-50 SII），上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；水平電泳槽及成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-rad公司；超凈工作臺(tái)（SEX-TJ），上海整新電子設(shè)備；天平Y(jié)P200N，上海菁海儀器有限公司；PCR 儀（2720 Thermal Cycler），美國(guó)Thermo 公司；樣品處理儀（MP Fastprep-24），美國(guó)MP 公司。

1.2.2 主要試劑 瓊脂粉，上海藍(lán)季生物科技有限公司；甘油、瓊脂糖，均購(gòu)于國(guó)藥；基因組DNA提 取試劑盒、DNA Maker、4s Green 無(wú)毒核酸染料、PCR 引物，上海生工生物技術(shù)有限公司；Taq酶、ddH2O，上海拜力生物科技有限公司；腦心浸出液（Brain Heart Infusion，BHI）培養(yǎng)基、乳酸菌培養(yǎng)基（MRS），英國(guó)OXIOD 公司。

1.2.3 指示菌株 本次試驗(yàn)的指示菌株均由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所保存，所需的指示菌及培養(yǎng)條件等見表1。

表1 指示菌株及其培養(yǎng)條件Table 1 Bacterial strains and their growth conditions

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理 無(wú)菌條件下，稱取10 g 牡蠣肉剪碎研磨，添加到裝有90 mL 生理鹽水的樣品處理袋中，將樣品在處理器中均質(zhì)混勻2 min，用生理鹽水梯度稀釋至10-4備用。

1.3.2 菌株分離與培養(yǎng) 采用稀釋涂布平板法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行單菌落分離。分別從10-3、10-4兩個(gè)稀釋度的稀釋液中吸取100 μL 樣品液于BHI 培養(yǎng)基上，均勻涂布后置于30 ℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)。長(zhǎng)出菌落后，無(wú)菌條件下挑選單菌落，接種于5 mL BHI 液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)。

1.3.3 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的篩選

1.3.3.1 初篩 采用瓊脂點(diǎn)種法進(jìn)行細(xì)菌素初篩試驗(yàn)[14]。將100 μL 過(guò)夜培養(yǎng)的指示菌添加到5 mL BHI 培養(yǎng)基（含0.8%的瓊脂粉）中，倒入BHI培養(yǎng)基（含2.5%的瓊脂粉）上，均勻平鋪。待其冷卻凝固并且干燥后，吸取2 μL 指標(biāo)菌進(jìn)行點(diǎn)樣，置于30 ℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，在培養(yǎng)基上出現(xiàn)明亮抑菌圈的則認(rèn)為有抑菌活性，能抑制相應(yīng)的指示菌。對(duì)有抑菌活性的菌株在體積分?jǐn)?shù)13%的甘油中保存，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 細(xì)菌素對(duì)熱和酶的穩(wěn)定性測(cè)試

1）細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)：將過(guò)夜培養(yǎng)的指標(biāo)菌液在10 000 r/min 條件下離心5 min。將上清液在沸水中放置15 min，然后冰上冷卻5 min。吸取3 μL 加熱后的上清液，進(jìn)行瓊脂點(diǎn)種法進(jìn)行抑菌，未經(jīng)熱處理的上清液作為對(duì)照。

2）細(xì)菌素對(duì)酶的穩(wěn)定性測(cè)試：將指標(biāo)菌過(guò)夜培養(yǎng)，吸取2 μL 菌液，采用瓊脂點(diǎn)種法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)；在點(diǎn)過(guò)指標(biāo)菌位置的邊緣，點(diǎn)上1 μL 質(zhì)量濃度為20 μg/mL 的蛋白酶K，30 ℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)。未經(jīng)蛋白酶K 處理的菌液作為對(duì)照。

1.3.4 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的分類鑒定

1.3.4.1 形態(tài)特征 參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行菌株形態(tài)特征鑒定。將菌株接種于BHI 平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀察各個(gè)平板菌落形態(tài)，采用革蘭氏染色法觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3.4.2 菌株基因組DNA 提取，PCR 擴(kuò)增和菌株鑒定 對(duì)具有抑菌效果的指標(biāo)菌，按生工Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒（上海生工）提供的使用方法提取其DNA。以指示菌基因組DNA作為PCR 擴(kuò)增的模板，采用通用引物15F 和12R（表2）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[23]。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：Taq PCR Master Mix（2x，blue dye）（上海生工）25 μL，上游引物 （10 μmol/L）2 μL，下游引物（10 μmol/L）2 μL，基因組DNA 模板2 μL，雙蒸水19 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；進(jìn)入PCR 循環(huán)階段后，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后在UV 燈下觀察到擴(kuò)增條帶后將未純化的PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行菌種鑒定。測(cè)序結(jié)果所得的基因序列通過(guò)在NCBI 的Blast 檢索系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 序列比對(duì)。

1.3.5 重復(fù)片段基因指紋分析 （Repetitive-element genomic PCR fingerprinting，rep-PCR）以細(xì)菌基因組DNA 為模板，參考Silva 等[24]的方法，利用設(shè)計(jì)的BOX 引物[25]（引物序列見表2）進(jìn)行rep-PCR 擴(kuò)增。待擴(kuò)增完成后，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳并在UV 燈下觀察電泳結(jié)果。

表2 PCR 擴(kuò)增引物序列信息Table 2 Primer sequence information of PCR amplifications

1.3.6 系統(tǒng)發(fā)育樹 將校正并拼接后的序列在Gen Bank （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中進(jìn)行同源序列的搜索，由rep-PCR 得到的大致條帶情況，從差異估計(jì)出發(fā)，采用層次UPGMA 法（Unweighted Pair-Group Mean Average），根據(jù)供試菌株的rep-PCR 擴(kuò)增條帶的大小，采用二進(jìn)制方法，生成系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.7 質(zhì)粒提取 將產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌菌株過(guò)夜培養(yǎng)，利用質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGA bio-tek，上海），根據(jù)試劑盒上的介紹對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)的產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取。將提取好的質(zhì)粒DNA 在1.5%的瓊脂糖凝膠下進(jìn)行電泳并在UV燈下觀察電泳結(jié)果。

1.3.8 細(xì)菌素粗提

1.3.8.1 硫酸銨鹽析沉淀法 按1%接種量將過(guò)夜培養(yǎng)好的產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌接種到250 mL 的BHI 液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃培養(yǎng)至少12 h。將上述過(guò)夜培養(yǎng)好的菌液于4 ℃，10 000 r/min 離心條件下離心25 min，在上清液中添加45%的飽和硫酸銨攪拌溶解，置于4 ℃過(guò)夜。將過(guò)夜的溶液在10 000 r/min 條件下離心30 min，將沉淀溶解于5 mL 磷酸鹽緩沖液PBS（pH 6.86）中，即得到細(xì)菌素粗提物。

1.3.8.2 凝膠過(guò)濾層析 以Sephadex G-25 為凝膠填料，超純水進(jìn)行預(yù)洗脫后再用PBS 洗脫柱子，細(xì)菌素粗提物5 mL 上樣，流速0.5 mL/min，先使用PBS 進(jìn)行洗脫，之后用0.2，0.5 mol/L 的氯化鈉（NaCl）依次進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。分別對(duì)收集的洗脫液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)（吸取2 μL 粗提物抑制蠟樣芽孢桿菌），將有抑菌效果的洗脫液進(jìn)行凍干濃縮后復(fù)溶于pH 6.86 的PBS 中置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.9 三羥甲基甘氨酸-SDS-PAGE 電泳（Tricine-SDS-PAGE）參 考Sch?gger 等[26]的 方法，將凍干濃縮好的細(xì)菌素粗提純物質(zhì)在Tricine-SDS-PAGE 進(jìn)行電泳。其中膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為夾層膠10%，濃縮膠4%，分離膠16.5%。采用分子質(zhì)量3.3～20.1 ku 的肽Marker（Solarbio）作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。電泳結(jié)束后使用考馬斯亮藍(lán)G 250 進(jìn)行染色脫色，將電泳膠在Bio-rad 成像系統(tǒng)下記錄結(jié)果。

1.3.10 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用 將產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌菌株在30 ℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的菌液在10 000 r/min 條件下離心30 min，取上清液加熱15 min 處理后，參考Sun 等[27]的方法，將上清液通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用 （Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析蛋白質(zhì)分子質(zhì)量。利用現(xiàn)有蛋白質(zhì)組學(xué)信息庫(kù)（Omicsbean）對(duì)獲得的蛋白質(zhì)進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的篩選及鑒定

從牡蠣中初步篩選出的對(duì)常見食源性致病菌有抑菌活性的菌株有14 株 （命名為O、S、18、19、26、27、4、6、4-1、F1、F2、F4、Y1、Y2）。這些細(xì)菌在平板上具有典型的芽孢桿菌形態(tài)，即菌體扁平、粗糙不透明、邊緣不整齊、微黃色，且革蘭氏染色后結(jié)果均呈陽(yáng)性。這14 株菌對(duì)常見致病菌的抑菌譜見表3。其中O、18、19、26、27、4-1、F1、F2、F4、Y1、Y2 等菌株具有廣譜抑菌性，不僅對(duì)金黃色葡萄球菌（S.aureus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、植物乳桿菌（L.plantanrum）等革蘭氏陽(yáng)性菌具有較好的抑菌效果，而且對(duì)弗氏檸檬酸桿菌 （C.freundii）、副溶血性弧菌（V.parahemolyticus）、大腸桿菌（E.coli）、腸道沙門氏菌（S.enterica）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）等革蘭氏陰性菌也具有很好的抑制作用。另外，由表3還可以看出，菌株18、19、26、27 具有相似的抑菌譜，菌株F1、F2、F4、Y1、Y2 等抑菌能力也十分相似。

表3 14 株芽孢桿菌菌株的抑菌譜Table 3 Antibacterial spectrum of 14 strains of Bacillus

將具有抑菌活性的細(xì)菌送檢測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)在NCBI 上進(jìn)行Blast 序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這14株指標(biāo)菌株與芽孢桿菌屬同源性最高，均高達(dá)99%以上，可初步判斷其均屬于芽孢桿菌屬。其中，O 為解淀粉芽孢桿菌 （B.amyloliquefaciens），18、19、26、27 以及F1、F2、F4、Y1 和Y2 等菌株均為枯草芽孢桿菌 （B.subtilis），4、6、S 分別為短小芽孢桿菌（B.pumilus）、廈門芽孢桿菌（B.xiamenensis）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus），4-1 為死亡谷芽孢桿菌（B.vallismortis）。

2.2 細(xì)菌素對(duì)熱和酶的穩(wěn)定性測(cè)試

細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)除了細(xì)菌素外，還可以代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、抗生素和H2O2等其它具有抑菌活性的物質(zhì)。為了排除其它干擾因素，通過(guò)加熱處理和酶處理方式確定抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素。篩選出的14 株菌在加熱后保持較好的抑菌活性。此外，經(jīng)過(guò)蛋白酶K 處理的平板點(diǎn)菌處抑菌圈不完整，這一結(jié)果說(shuō)明抑菌活性物質(zhì)是熱穩(wěn)定性強(qiáng)的細(xì)菌素。

2.3 重復(fù)片段基因指紋分析（rep-PCR）和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

為了確定同一種屬的細(xì)菌基因型是否一致，本試驗(yàn)通過(guò)利用特殊設(shè)計(jì)的引物即BOX 引物對(duì)抑菌譜相似且鑒定結(jié)果相似的菌株的DNA 進(jìn)行rep-PCR 擴(kuò)增，確定其相應(yīng)的基因圖譜，以便進(jìn)一步對(duì)細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分。Rep-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后的結(jié)果如圖1。結(jié)果顯示，18、26、27 的擴(kuò)增產(chǎn)物基因圖譜基本一致，即重復(fù)片段基本一致，可以初步判斷為一種菌；F1、F2、F4、Y1、Y2 等菌株的基因圖譜也呈現(xiàn)出一致性，可判斷為同一種菌；4-1 與F1、F2、F4、Y1、Y2 的rep-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在＜1.0 kb 相似，但在＞1.0 kb 處條帶略有不同，初步判斷是同屬但不同種的菌；O、S、4、6、4-1的條帶各不相同，可以判斷為同一種屬的不同菌。

根據(jù)rep-PCR 擴(kuò)增條帶結(jié)果，采用二進(jìn)制方法，利用UPGMA 軟件構(gòu)建得到相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖2）。結(jié)果顯示菌株Y1、F4、Y2、F2、F1 的同源性較高，另外，菌株18、26、27 位于一個(gè)分支簇，該結(jié)果與rep-PCR 結(jié)果一致。鑒于rep-PCR基因指紋圖譜和系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果，結(jié)合芽孢桿菌抑菌譜范圍，可以初步判斷O、19、F 和4-1 與其它細(xì)菌不同，因此后續(xù)將選用這4 株產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌用于進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.4 質(zhì)粒提取

細(xì)菌素是通過(guò)核糖體合成產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)。通常情況下細(xì)菌素通過(guò)在染色體上編碼產(chǎn)生，也可以通過(guò)質(zhì)粒產(chǎn)生，也有一些細(xì)菌素的合成是受染色體和質(zhì)粒的雙重調(diào)控產(chǎn)生[28-31]。為了確定上述細(xì)菌素產(chǎn)生的位置，本試驗(yàn)通過(guò)提取質(zhì)粒中DNA，初步判斷編碼細(xì)菌素的基因是否位于質(zhì)粒，以便于進(jìn)一步對(duì)編碼細(xì)菌素的基因序列或者結(jié)構(gòu)分析提供依據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這4 株細(xì)菌未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒。這一結(jié)果說(shuō)明這些芽孢桿菌主要是通過(guò)染色體上的編碼基因產(chǎn)生細(xì)菌素。

圖1 Rep-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Rep-PCR amplification products via 1.5%agarose gel electrophoresis

圖2 基于rep-PCR 圖譜構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on rep-PCR mapping results

2.5 細(xì)菌素粗提

硫酸銨提取得到的細(xì)菌素粗提物對(duì)蠟樣芽孢桿菌有明顯的抑菌效果。用PBS 和0.2 mol/L NaCl溶液洗脫經(jīng)硫酸銨得到的細(xì)菌素粗提物并分別收集其洗脫液然后凍干。經(jīng)抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)PBS和0.2 mol/L NaCl 洗脫的組分可以較好地抑制蠟樣芽孢桿菌（圖3）。

2.6 三羥甲基甘氨酸-SDS-PAGE 電泳結(jié)果

圖4是產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌的Tricine-SDSPAGE 電泳結(jié)果。由于Tricine-SDS-PAGE 電泳可以較好地分離＜30 ku 的蛋白，因此選用3.3～20.1 ku 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白做對(duì)照。與Marker 條帶對(duì)比可知菌株O 在14.4 ku 左右時(shí)有一條較為明顯的條帶。菌株19 在8 ku 和18 ku 處有明顯的蛋白條帶。菌株F 則在8 ku 處、14.4 ku 左右均出現(xiàn)明顯的條帶。菌株4-1 在14.4 ku 左右時(shí)有一條蛋白條帶。4 株芽孢桿菌的Tricine-SDS-PAGE 電泳結(jié)果可以初步判斷出其所產(chǎn)細(xì)菌素的分子質(zhì)量均小于20 ku。該結(jié)果也表明這些菌株所產(chǎn)細(xì)菌素可能為熱穩(wěn)定性較好的II 類小分子蛋白。

2.7 LC-MS/MS 鑒定結(jié)果

表4為產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌的LC-MS/MS 鑒定結(jié)果。結(jié)合Tricine-SDS-PAGE 電泳試驗(yàn)結(jié)果可以初步判斷菌株O 所產(chǎn)細(xì)菌素可能為13 ku 大小的含有DUF1093 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)、13.506 ku 大小的YlbF 家族監(jiān)管蛋白及18.877 ku 的1 型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶；菌株19 產(chǎn)生的細(xì)菌素可能為8.969 ku 的假設(shè)蛋白CXF51_07005、16.871 ku 大小的SPBc2原噬菌體衍生的蛋白質(zhì)YolA 以及18.001 ku 大小的假設(shè)蛋白BEST7613_2224；菌株F 所產(chǎn)細(xì)菌素可能為分子質(zhì)量大小為8.089 ku 的假設(shè)蛋白C1T28_21195、13.011 ku 大小的降解酶（加氧酶）、15.786 ku 大小的holin 家族蛋白質(zhì)以及分子質(zhì)量為17.082 ku 的SMI1/KNR4 家族蛋白；菌株4-1產(chǎn)生的細(xì)菌素可能對(duì)應(yīng)為9.439 ku 的小分子質(zhì)量的酸溶性孢子蛋白Tlp 或是分子質(zhì)量為22.529 ku 的3-己酮糖-6-磷酸合成酶。目前的結(jié)果與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)已編號(hào)的蛋白比較，沒有完全一致的蛋白相匹配，表明本研究中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌素不排除為新型細(xì)菌素的可能。細(xì)菌素進(jìn)一步純化，氨基酸序列比對(duì)和產(chǎn)細(xì)菌素的細(xì)菌全基因組序列進(jìn)行測(cè)序分析，從而準(zhǔn)確判斷這4 株芽孢桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素是否為新型細(xì)菌素。

圖3 細(xì)菌素粗提物對(duì)蠟樣芽孢桿菌2805 的抑菌作用Fig.3 The antibacterial effect of the initial extract of bacteriocin on strain B.cereus 2805

圖4 三羥甲基甘氨酸-SDS-PAGE 電泳結(jié)果Fig.4 Results of Tricine-SDS-PAGE electrophoresis

表4 產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌菌株的LC-MS/MS 鑒定結(jié)果Table 4 Identification results of LC-MS/MS of bacteriocin producting from Bacillus sp.

（續(xù)表4）

3 結(jié)論

本研究從福建牡蠣中分離篩選出14 株對(duì)常見致病菌有抑菌活性的芽孢桿菌菌株，通過(guò)抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些芽孢桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、植物乳桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌及弗氏檸檬酸桿菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、腸道沙門氏菌、志賀氏菌等革蘭氏陰性菌均有一定的抑菌作用。同時(shí)，這些芽孢桿菌產(chǎn)的細(xì)菌素具有熱穩(wěn)定性強(qiáng)、易被蛋白酶分解和由核糖體編碼合成產(chǎn)生細(xì)菌素等典型細(xì)菌素特征。根據(jù)14 株菌的抑菌譜范圍和rep-PCR 結(jié)果，初步判斷4 種菌株可能不同于其它芽孢桿菌。因此，選取這4 株菌O（解淀粉芽孢桿菌），4-1（死亡谷芽孢桿菌），19 和F（枯草芽孢桿菌）進(jìn)行下一步試驗(yàn)。通過(guò)Tricine-SDSPAGE 電泳試驗(yàn)，這4 株芽孢桿菌產(chǎn)的細(xì)菌素分子質(zhì)量均不大于20 ku。說(shuō)明上述4 株細(xì)菌可能產(chǎn)II 類乳酸菌細(xì)菌素。利用LC-MS/MS 鑒定并比對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果顯示這4 株芽孢桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素未在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌素進(jìn)一步純化，氨基酸序列比對(duì)和產(chǎn)細(xì)菌素的細(xì)菌全基因組序列進(jìn)行測(cè)序分析仍需在未來(lái)試驗(yàn)中進(jìn)行，從而準(zhǔn)確確定這4 株芽孢桿菌的細(xì)菌素性質(zhì)。