王 偉,陳淵戈,遲 海*,陶樂仁
(1 中國水產科學研究院東海水產研究所 上海200090 2 上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院 上海200093)
食源性致病菌的污染和增殖是嚴重威脅食品安全和公共健康的因素之一,成為人們關注的熱點問題[1-2]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù),世界上每年有近十分之一的人因食品污染而患病,近42 萬人死于食源性疾病[3]。食品添加劑作為延長食品貨架期的一種手段,可以抑制食源性致病菌的生長,然而食品添加劑潛在危害及添加劑量成為消費者擔憂的問題[4]。同時,抗生素作為主要抑制食源性疾病的源頭藥物,其長期濫用導致食源性致病菌的耐藥性問題愈發(fā)嚴重[5]。鑒于此,研究人員不斷尋找天然的防腐劑以及不易產生耐藥性的天然抗菌物質作為食品添加劑及抗生素的替代品。
細菌素是細菌核糖體內合成的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質,主要對親緣關系較近的微生物有一定的抑制作用[6]。細菌素具有高效、無毒、穩(wěn)定性強、無殘留以及不易產生抗藥性等優(yōu)點,被普遍認為是抗生素及化學添加劑的替代物之一[7-8]。目前真正用于商業(yè)化的乳酸菌細菌素僅有乳酸鏈球菌素(nisin)和片球菌素(pediocin PA-1)[9]。造成這種現(xiàn)象的原因主要是乳酸菌細菌素的性質(如有些乳酸菌細菌素抑菌譜窄、pH 敏感性及熱穩(wěn)定性差)和分離純化方法等諸多因素限制了乳酸菌細菌素的獲取及其工業(yè)化生產[10-11]。篩選具有廣譜抑菌作用,pH 耐受范圍廣,熱穩(wěn)定性好的新型細菌素對食品安全具有重要意義。
芽孢桿菌(Bacillus sp.)作為動植物和微生態(tài)的優(yōu)勢菌,不僅種類繁多、穩(wěn)定性強,而且廣泛存在于自然界中[12-13]。由芽孢桿菌中地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、凝結芽孢桿菌(B.coagulans)等產生的細菌素也逐步被關注和發(fā)現(xiàn)[14-21]。本研究從福建霞浦海域的牡蠣中分離出不同的細菌,并以常見的食源性致病菌:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)等為指示菌,系統(tǒng)篩選具有廣譜抑菌作用的產細菌素的細菌。其中分離出具有廣譜抑菌活性的14 株細菌經16s rDNA 基因鑒定為芽孢桿菌。這些芽孢桿菌所產的細菌素主要是由核糖體合成,并具有熱穩(wěn)定性和酶敏感性等特點。結合Tricine-SDS-PAGE 電泳試驗結果及LC-MS/MS鑒定,潛在細菌素的分子質量范圍及對應的氨基酸序列均顯示上述廣譜細菌素可能未被發(fā)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)的新型廣譜細菌素期望為細菌素的開發(fā)利用及其在食品安全領域的應用提供基礎數(shù)據(jù)。
牡蠣產自福建霞浦海域,樣品放置于-18 ℃運至實驗室備用。
1.2.1 試驗設備 低溫恒溫培養(yǎng)箱 (MIR-153),日本三洋(SANYO)電機公司;立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-50 SII),上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;水平電泳槽及成像系統(tǒng),美國Bio-rad公司;超凈工作臺(SEX-TJ),上海整新電子設備;天平YP200N,上海菁海儀器有限公司;PCR 儀(2720 Thermal Cycler),美國Thermo 公司;樣品處理儀(MP Fastprep-24),美國MP 公司。
1.2.2 主要試劑 瓊脂粉,上海藍季生物科技有限公司;甘油、瓊脂糖,均購于國藥;基因組DNA提 取試劑盒、DNA Maker、4s Green 無毒核酸染料、PCR 引物,上海生工生物技術有限公司;Taq酶、ddH2O,上海拜力生物科技有限公司;腦心浸出液(Brain Heart Infusion,BHI)培養(yǎng)基、乳酸菌培養(yǎng)基(MRS),英國OXIOD 公司。
1.2.3 指示菌株 本次試驗的指示菌株均由中國水產科學研究院東海水產研究所保存,所需的指示菌及培養(yǎng)條件等見表1。
表1 指示菌株及其培養(yǎng)條件Table 1 Bacterial strains and their growth conditions
1.3.1 樣品處理 無菌條件下,稱取10 g 牡蠣肉剪碎研磨,添加到裝有90 mL 生理鹽水的樣品處理袋中,將樣品在處理器中均質混勻2 min,用生理鹽水梯度稀釋至10-4備用。
1.3.2 菌株分離與培養(yǎng) 采用稀釋涂布平板法對細菌進行單菌落分離。分別從10-3、10-4兩個稀釋度的稀釋液中吸取100 μL 樣品液于BHI 培養(yǎng)基上,均勻涂布后置于30 ℃條件下過夜培養(yǎng)。長出菌落后,無菌條件下挑選單菌落,接種于5 mL BHI 液體培養(yǎng)基中,置于30 ℃條件下過夜培養(yǎng)。
1.3.3 產細菌素菌株的篩選
1.3.3.1 初篩 采用瓊脂點種法進行細菌素初篩試驗[14]。將100 μL 過夜培養(yǎng)的指示菌添加到5 mL BHI 培養(yǎng)基(含0.8%的瓊脂粉)中,倒入BHI培養(yǎng)基(含2.5%的瓊脂粉)上,均勻平鋪。待其冷卻凝固并且干燥后,吸取2 μL 指標菌進行點樣,置于30 ℃條件下過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后,在培養(yǎng)基上出現(xiàn)明亮抑菌圈的則認為有抑菌活性,能抑制相應的指示菌。對有抑菌活性的菌株在體積分數(shù)13%的甘油中保存,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.3.2 細菌素對熱和酶的穩(wěn)定性測試
1)細菌素的熱穩(wěn)定性試驗:將過夜培養(yǎng)的指標菌液在10 000 r/min 條件下離心5 min。將上清液在沸水中放置15 min,然后冰上冷卻5 min。吸取3 μL 加熱后的上清液,進行瓊脂點種法進行抑菌,未經熱處理的上清液作為對照。
2)細菌素對酶的穩(wěn)定性測試:將指標菌過夜培養(yǎng),吸取2 μL 菌液,采用瓊脂點種法進行抑菌試驗;在點過指標菌位置的邊緣,點上1 μL 質量濃度為20 μg/mL 的蛋白酶K,30 ℃條件下過夜培養(yǎng)。未經蛋白酶K 處理的菌液作為對照。
1.3.4 產細菌素菌株的分類鑒定
1.3.4.1 形態(tài)特征 參照文獻[22]進行菌株形態(tài)特征鑒定。將菌株接種于BHI 平板,37 ℃過夜培養(yǎng),觀察各個平板菌落形態(tài),采用革蘭氏染色法觀察細菌形態(tài)。
1.3.4.2 菌株基因組DNA 提取,PCR 擴增和菌株鑒定 對具有抑菌效果的指標菌,按生工Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒(上海生工)提供的使用方法提取其DNA。以指示菌基因組DNA作為PCR 擴增的模板,采用通用引物15F 和12R(表2)進行PCR 擴增[23]。PCR 反應體系(50 μL):Taq PCR Master Mix(2x,blue dye)(上海生工)25 μL,上游引物 (10 μmol/L)2 μL,下游引物(10 μmol/L)2 μL,基因組DNA 模板2 μL,雙蒸水19 μL。擴增反應條件為:94 ℃預變性4 min;進入PCR 循環(huán)階段后,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min,4℃保存。PCR 產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后在UV 燈下觀察到擴增條帶后將未純化的PCR 產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行菌種鑒定。測序結果所得的基因序列通過在NCBI 的Blast 檢索系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 序列比對。
1.3.5 重復片段基因指紋分析 (Repetitive-element genomic PCR fingerprinting,rep-PCR)以細菌基因組DNA 為模板,參考Silva 等[24]的方法,利用設計的BOX 引物[25](引物序列見表2)進行rep-PCR 擴增。待擴增完成后,將PCR 產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳并在UV 燈下觀察電泳結果。
表2 PCR 擴增引物序列信息Table 2 Primer sequence information of PCR amplifications
1.3.6 系統(tǒng)發(fā)育樹 將校正并拼接后的序列在Gen Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中進行同源序列的搜索,由rep-PCR 得到的大致條帶情況,從差異估計出發(fā),采用層次UPGMA 法(Unweighted Pair-Group Mean Average),根據(jù)供試菌株的rep-PCR 擴增條帶的大小,采用二進制方法,生成系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.3.7 質粒提取 將產細菌素芽孢桿菌菌株過夜培養(yǎng),利用質粒提取試劑盒(OMEGA bio-tek,上海),根據(jù)試劑盒上的介紹對過夜培養(yǎng)的產細菌素芽孢桿菌菌株進行質粒提取。將提取好的質粒DNA 在1.5%的瓊脂糖凝膠下進行電泳并在UV燈下觀察電泳結果。
1.3.8 細菌素粗提
1.3.8.1 硫酸銨鹽析沉淀法 按1%接種量將過夜培養(yǎng)好的產細菌素芽孢桿菌接種到250 mL 的BHI 液體培養(yǎng)基中,置于30 ℃培養(yǎng)至少12 h。將上述過夜培養(yǎng)好的菌液于4 ℃,10 000 r/min 離心條件下離心25 min,在上清液中添加45%的飽和硫酸銨攪拌溶解,置于4 ℃過夜。將過夜的溶液在10 000 r/min 條件下離心30 min,將沉淀溶解于5 mL 磷酸鹽緩沖液PBS(pH 6.86)中,即得到細菌素粗提物。
1.3.8.2 凝膠過濾層析 以Sephadex G-25 為凝膠填料,超純水進行預洗脫后再用PBS 洗脫柱子,細菌素粗提物5 mL 上樣,流速0.5 mL/min,先使用PBS 進行洗脫,之后用0.2,0.5 mol/L 的氯化鈉(NaCl)依次進行洗脫,收集洗脫液。分別對收集的洗脫液進行抑菌試驗(吸取2 μL 粗提物抑制蠟樣芽孢桿菌),將有抑菌效果的洗脫液進行凍干濃縮后復溶于pH 6.86 的PBS 中置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>
1.3.9 三羥甲基甘氨酸-SDS-PAGE 電泳(Tricine-SDS-PAGE)參 考Sch?gger 等[26]的 方法,將凍干濃縮好的細菌素粗提純物質在Tricine-SDS-PAGE 進行電泳。其中膠質量分數(shù)分別為夾層膠10%,濃縮膠4%,分離膠16.5%。采用分子質量3.3~20.1 ku 的肽Marker(Solarbio)作為標準對照。電泳結束后使用考馬斯亮藍G 250 進行染色脫色,將電泳膠在Bio-rad 成像系統(tǒng)下記錄結果。
1.3.10 液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用 將產細菌素芽孢桿菌菌株在30 ℃條件下過夜培養(yǎng),將培養(yǎng)好的菌液在10 000 r/min 條件下離心30 min,取上清液加熱15 min 處理后,參考Sun 等[27]的方法,將上清液通過液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用 (Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析蛋白質分子質量。利用現(xiàn)有蛋白質組學信息庫(Omicsbean)對獲得的蛋白質進行對比分析。
從牡蠣中初步篩選出的對常見食源性致病菌有抑菌活性的菌株有14 株 (命名為O、S、18、19、26、27、4、6、4-1、F1、F2、F4、Y1、Y2)。這些細菌在平板上具有典型的芽孢桿菌形態(tài),即菌體扁平、粗糙不透明、邊緣不整齊、微黃色,且革蘭氏染色后結果均呈陽性。這14 株菌對常見致病菌的抑菌譜見表3。其中O、18、19、26、27、4-1、F1、F2、F4、Y1、Y2 等菌株具有廣譜抑菌性,不僅對金黃色葡萄球菌(S.aureus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、植物乳桿菌(L.plantanrum)等革蘭氏陽性菌具有較好的抑菌效果,而且對弗氏檸檬酸桿菌 (C.freundii)、副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)、大腸桿菌(E.coli)、腸道沙門氏菌(S.enterica)、福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)等革蘭氏陰性菌也具有很好的抑制作用。另外,由表3還可以看出,菌株18、19、26、27 具有相似的抑菌譜,菌株F1、F2、F4、Y1、Y2 等抑菌能力也十分相似。
表3 14 株芽孢桿菌菌株的抑菌譜Table 3 Antibacterial spectrum of 14 strains of Bacillus
將具有抑菌活性的細菌送檢測序,其測序結果經過在NCBI 上進行Blast 序列比對,發(fā)現(xiàn)這14株指標菌株與芽孢桿菌屬同源性最高,均高達99%以上,可初步判斷其均屬于芽孢桿菌屬。其中,O 為解淀粉芽孢桿菌 (B.amyloliquefaciens),18、19、26、27 以及F1、F2、F4、Y1 和Y2 等菌株均為枯草芽孢桿菌 (B.subtilis),4、6、S 分別為短小芽孢桿菌(B.pumilus)、廈門芽孢桿菌(B.xiamenensis)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus),4-1 為死亡谷芽孢桿菌(B.vallismortis)。
細菌生長過程中產生的抑菌物質除了細菌素外,還可以代謝產生有機酸、抗生素和H2O2等其它具有抑菌活性的物質。為了排除其它干擾因素,通過加熱處理和酶處理方式確定抑菌物質為細菌素。篩選出的14 株菌在加熱后保持較好的抑菌活性。此外,經過蛋白酶K 處理的平板點菌處抑菌圈不完整,這一結果說明抑菌活性物質是熱穩(wěn)定性強的細菌素。
為了確定同一種屬的細菌基因型是否一致,本試驗通過利用特殊設計的引物即BOX 引物對抑菌譜相似且鑒定結果相似的菌株的DNA 進行rep-PCR 擴增,確定其相應的基因圖譜,以便進一步對細菌進行區(qū)分。Rep-PCR 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后的結果如圖1。結果顯示,18、26、27 的擴增產物基因圖譜基本一致,即重復片段基本一致,可以初步判斷為一種菌;F1、F2、F4、Y1、Y2 等菌株的基因圖譜也呈現(xiàn)出一致性,可判斷為同一種菌;4-1 與F1、F2、F4、Y1、Y2 的rep-PCR 擴增產物在<1.0 kb 相似,但在>1.0 kb 處條帶略有不同,初步判斷是同屬但不同種的菌;O、S、4、6、4-1的條帶各不相同,可以判斷為同一種屬的不同菌。
根據(jù)rep-PCR 擴增條帶結果,采用二進制方法,利用UPGMA 軟件構建得到相應的系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖2)。結果顯示菌株Y1、F4、Y2、F2、F1 的同源性較高,另外,菌株18、26、27 位于一個分支簇,該結果與rep-PCR 結果一致。鑒于rep-PCR基因指紋圖譜和系統(tǒng)發(fā)育樹的結果,結合芽孢桿菌抑菌譜范圍,可以初步判斷O、19、F 和4-1 與其它細菌不同,因此后續(xù)將選用這4 株產細菌素芽孢桿菌用于進一步試驗。
細菌素是通過核糖體合成產生的抑菌物質。通常情況下細菌素通過在染色體上編碼產生,也可以通過質粒產生,也有一些細菌素的合成是受染色體和質粒的雙重調控產生[28-31]。為了確定上述細菌素產生的位置,本試驗通過提取質粒中DNA,初步判斷編碼細菌素的基因是否位于質粒,以便于進一步對編碼細菌素的基因序列或者結構分析提供依據(jù)。結果發(fā)現(xiàn),這4 株細菌未發(fā)現(xiàn)質粒。這一結果說明這些芽孢桿菌主要是通過染色體上的編碼基因產生細菌素。
圖1 Rep-PCR 擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Rep-PCR amplification products via 1.5%agarose gel electrophoresis
圖2 基于rep-PCR 圖譜構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on rep-PCR mapping results
硫酸銨提取得到的細菌素粗提物對蠟樣芽孢桿菌有明顯的抑菌效果。用PBS 和0.2 mol/L NaCl溶液洗脫經硫酸銨得到的細菌素粗提物并分別收集其洗脫液然后凍干。經抑菌試驗發(fā)現(xiàn)經過PBS和0.2 mol/L NaCl 洗脫的組分可以較好地抑制蠟樣芽孢桿菌(圖3)。
圖4是產細菌素芽孢桿菌的Tricine-SDSPAGE 電泳結果。由于Tricine-SDS-PAGE 電泳可以較好地分離<30 ku 的蛋白,因此選用3.3~20.1 ku 的標準蛋白做對照。與Marker 條帶對比可知菌株O 在14.4 ku 左右時有一條較為明顯的條帶。菌株19 在8 ku 和18 ku 處有明顯的蛋白條帶。菌株F 則在8 ku 處、14.4 ku 左右均出現(xiàn)明顯的條帶。菌株4-1 在14.4 ku 左右時有一條蛋白條帶。4 株芽孢桿菌的Tricine-SDS-PAGE 電泳結果可以初步判斷出其所產細菌素的分子質量均小于20 ku。該結果也表明這些菌株所產細菌素可能為熱穩(wěn)定性較好的II 類小分子蛋白。
表4為產細菌素芽孢桿菌的LC-MS/MS 鑒定結果。結合Tricine-SDS-PAGE 電泳試驗結果可以初步判斷菌株O 所產細菌素可能為13 ku 大小的含有DUF1093 結構域的蛋白質、13.506 ku 大小的YlbF 家族監(jiān)管蛋白及18.877 ku 的1 型谷氨酰胺轉移酶;菌株19 產生的細菌素可能為8.969 ku 的假設蛋白CXF51_07005、16.871 ku 大小的SPBc2原噬菌體衍生的蛋白質YolA 以及18.001 ku 大小的假設蛋白BEST7613_2224;菌株F 所產細菌素可能為分子質量大小為8.089 ku 的假設蛋白C1T28_21195、13.011 ku 大小的降解酶(加氧酶)、15.786 ku 大小的holin 家族蛋白質以及分子質量為17.082 ku 的SMI1/KNR4 家族蛋白;菌株4-1產生的細菌素可能對應為9.439 ku 的小分子質量的酸溶性孢子蛋白Tlp 或是分子質量為22.529 ku 的3-己酮糖-6-磷酸合成酶。目前的結果與蛋白數(shù)據(jù)庫內已編號的蛋白比較,沒有完全一致的蛋白相匹配,表明本研究中發(fā)現(xiàn)的細菌素不排除為新型細菌素的可能。細菌素進一步純化,氨基酸序列比對和產細菌素的細菌全基因組序列進行測序分析,從而準確判斷這4 株芽孢桿菌所產細菌素是否為新型細菌素。
圖3 細菌素粗提物對蠟樣芽孢桿菌2805 的抑菌作用Fig.3 The antibacterial effect of the initial extract of bacteriocin on strain B.cereus 2805
圖4 三羥甲基甘氨酸-SDS-PAGE 電泳結果Fig.4 Results of Tricine-SDS-PAGE electrophoresis
表4 產細菌素芽孢桿菌菌株的LC-MS/MS 鑒定結果Table 4 Identification results of LC-MS/MS of bacteriocin producting from Bacillus sp.
(續(xù)表4)
本研究從福建牡蠣中分離篩選出14 株對常見致病菌有抑菌活性的芽孢桿菌菌株,通過抑菌試驗發(fā)現(xiàn)這些芽孢桿菌對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、植物乳桿菌等革蘭氏陽性菌及弗氏檸檬酸桿菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、腸道沙門氏菌、志賀氏菌等革蘭氏陰性菌均有一定的抑菌作用。同時,這些芽孢桿菌產的細菌素具有熱穩(wěn)定性強、易被蛋白酶分解和由核糖體編碼合成產生細菌素等典型細菌素特征。根據(jù)14 株菌的抑菌譜范圍和rep-PCR 結果,初步判斷4 種菌株可能不同于其它芽孢桿菌。因此,選取這4 株菌O(解淀粉芽孢桿菌),4-1(死亡谷芽孢桿菌),19 和F(枯草芽孢桿菌)進行下一步試驗。通過Tricine-SDSPAGE 電泳試驗,這4 株芽孢桿菌產的細菌素分子質量均不大于20 ku。說明上述4 株細菌可能產II 類乳酸菌細菌素。利用LC-MS/MS 鑒定并比對現(xiàn)有蛋白質數(shù)據(jù)庫,結果顯示這4 株芽孢桿菌所產細菌素未在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn),細菌素進一步純化,氨基酸序列比對和產細菌素的細菌全基因組序列進行測序分析仍需在未來試驗中進行,從而準確確定這4 株芽孢桿菌的細菌素性質。