李 濤，宋洪波，2，安鳳平，2*，何 洪，黃 群，2

（1 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州350002） 2 福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州350002）

高脂飲食可導(dǎo)致血脂升高，嚴(yán)重時(shí)可引起一些危害人體健康的疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和胰腺炎等，已成為現(xiàn)代社會(huì)人群主要的營養(yǎng)問題之一[1-2]。此外，長期食用高脂膳食還可導(dǎo)致體脂異常積累和腸道微生物群的不平衡[3]。通過飲食干預(yù)預(yù)防由高脂飲食引起的健康問題正成為研究的熱點(diǎn)。

抗性淀粉在小腸中難以被酶解吸收，而在大腸中可被酵解，其通過上消化道進(jìn)入大腸，經(jīng)細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，調(diào)節(jié)腸道菌群[4]，降低血糖和膽固醇，抑制脂肪的吸收積累，改善慢性炎癥[5-6]。盲腸是大腸的起始段，雖然盲腸、結(jié)腸是細(xì)菌最密集和多樣的區(qū)域，且二者內(nèi)容物中菌群結(jié)構(gòu)具有相似性，但是優(yōu)勢(shì)菌群存在差異[7-8]。目前關(guān)于盲腸中菌群變化特征與改善因高脂飲食誘導(dǎo)高血脂和高血糖關(guān)系的研究少有報(bào)道。紫山藥（Purple Dioscorea alata L）為多年生藤本植物薯蕷（Dioscorea alata L）的塊莖，在我國南方地區(qū)廣泛種植，淀粉約占生物總量的16%～20%[9]。

本研究以紫山藥高抗性淀粉為原料，揭示紫山藥高抗性淀粉對(duì)盲腸微生物的益生作用及其改善高血脂癥效能，可為盲腸菌群及脂質(zhì)代謝與健康的研究提供依據(jù)。

1 材料和設(shè)備

1.1 材料與試劑

紫山藥（紫玉淮山），產(chǎn)自福建省三明市建寧縣。普魯蘭酶（2 800 U/g）、高溫α-淀粉酶（8 000 U/mL），美國Sigma 公司；淀粉葡糖苷酶（100 000 U/mL），上海麥克林生化科技有限公司；D-葡萄糖檢測(cè)試劑盒，愛爾蘭Megazyme 公司；血脂試劑盒，南京建成生物工程研究所；TIANamp Stool DNA kit 試劑盒，天根生化科技有限公司；檸檬酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純。

基礎(chǔ)飼料成分：碳水化合物72.3%、蛋白質(zhì)14.9%、脂肪12.8%；高脂飼料成分：氫化椰子油5%，玉米油5%，膽固醇0.2%和基礎(chǔ)飼料89.8%。飼料購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.2 主要設(shè)備與儀器

DHG-9003A 型熱風(fēng)干燥箱，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；SYQ-DSX-280B 型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；TDL-5-A 型低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；VERTEX70 型傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克分析儀器公司；GA-3 型血糖儀，三諾生物傳感股份有限公司；CFX96 型熒光定量PCR 儀，美國Bio-Rad 公司；PE300 型Illumina MiSeq 測(cè)序儀，美國Illumina 公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 紫山藥抗性淀粉的制備

紫山藥淀粉的制備見文獻(xiàn)[9]。將50.0 g 紫山藥淀粉 （干基），加至200 mL 磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 5.0）中煮沸30 min，降溫至58 ℃；加入普魯蘭酶（2 800 U/g）攪拌12 h；調(diào)節(jié)至7.0，120℃保溫30 min，冷卻至4 ℃貯藏24 h，反復(fù)2 次；將沉淀粉40 ℃干燥后，稱取20.0 g 加入100 mL pH 6.0 乙酸鈉緩沖溶液，升溫至90 ℃，加入0.3 mL 高溫α-淀粉酶（8 000 U/mL）保持1 h，冷卻至60 ℃并用稀釋的檸檬酸調(diào)節(jié)pH 至4.5，加入0.3 mL 淀粉葡糖苷酶（100 000 U/mL）保持1 h；以3 000×g 離心15 min，蒸餾水洗滌淀粉3 次，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇洗滌3 次，40 ℃干燥24 h，粉碎過100 目篩，得高抗性淀粉（HRS）。經(jīng)檢測(cè)，HRS 中的快速消化淀粉、緩慢消化淀粉和抗性淀粉的含量分別為11.4%，28.4%和60.2%。

2.2 FTIR 分析

傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析根據(jù)Wang等[10]的方法稍做修改。將干燥的HRS 樣品與溴化鉀以1∶100～1∶150 的比例進(jìn)行混合，充分研磨。將研磨好的粉末倒入模具中抽真空壓片，12 MPa 的壓力下保持30 s，壓至透明，在4 000～400 cm-1掃描范圍內(nèi)利用傅里葉變換紅外光譜掃描儀觀察。

2.3 動(dòng)物模型建立

雄性金黃地鼠，SPF 級(jí)，6～8 周齡，體重90～110 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將32 只金黃地鼠隨機(jī)分為4 組飼喂：正常對(duì)照組（NC）：基礎(chǔ)飼料+等量生理鹽水；模型組（MC）：高脂飼料+等量生理鹽水；HRS 低劑量組（LR）：高脂飼料+0.5 g/100 g bw 高抗性淀粉；HRS 高劑量組（HR）：高脂飼料+1.5 g/100 g bw 高抗性淀粉。金黃地鼠自由采食、飲水，10 h/14 h 白晝交替喂養(yǎng)4 周。

2.4 盲腸內(nèi)容物收集

在第2 和第4 個(gè)周末禁食12 h，各試驗(yàn)組分別宰殺3 只和5 只金黃地鼠，收集盲腸內(nèi)容物包裝后于-80 ℃冷凍。

2.5 血清指標(biāo)測(cè)定和臟器變化

在第4 周末眼眶取血后處死，快速剝離肝臟、腎臟、脾臟、附睪和腎周的脂肪組織并稱重；將血液收集在采血管中，于4 000 r/min、4 ℃離心15 min，血清分裝在1.5 mL 離心管中，于-20 ℃保存?zhèn)溆?；按照血脂測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定甘油三脂（TG）、總膽固醇 （TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的濃度。

2.6 DNA 提取和16S rDNA 基因PCR 擴(kuò)增

使用TIANamp Stool DNA kit 試劑盒從金黃地鼠盲腸內(nèi)容物中提取DNA。以盲腸內(nèi)容物中細(xì)菌基因組為模板，以520F 和802R 為上下游引物，擴(kuò)增16S rDNA 的V4 區(qū)。其中，PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：10×Taq buffer 5 μL；d NTP 5 μL；上游引物515F（20 μmol/L）0.5 μL；下游引物806R（20 μmol/L）0.5 μL；Taq 酶0.5 μL；模板1 μL；dd H2O 37.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃3 min；94 ℃45 s，50 ℃60 s，72 ℃90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min[11]。

2.7 測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息分析

采用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制備測(cè)序文庫，在Illumina Miseq測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序；將測(cè)序條帶拼接，按照與參照序列≥97%的相似度聚類，建立OTU，并確定種系型。利用熱圖和分類組成分析（LEfSe 分析）分別研究金黃地鼠盲腸菌群豐度和分類組成的變化。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有檢測(cè)一式3 份，采用DPS 8.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表示為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。方差分析按5%顯著性水平進(jìn)行。

3 結(jié)果與討論

3.1 傅里葉變換紅外光譜

NS 和HRS 的紅外光譜圖如圖1所示。在NS光譜中，3 438 和2 928 cm-1處的強(qiáng)吸收峰分別對(duì)應(yīng)于O-H 和C-H 鍵伸縮振動(dòng)。在1 082 和1 160 cm-1對(duì)應(yīng)的是C-O 鍵伸縮振動(dòng)；1 646 cm-1處吸收峰與淀粉內(nèi)部的結(jié)晶水有關(guān)，是醛基的C=O 吸收峰[12]。這些吸收峰在HRS 中亦被觀察到，但是3 438，2 928 和1 646 cm-1處的峰較弱，表明HRS中羥基和醛基含量降低[13]。NS 在927 cm-1處有D-吡喃葡萄糖的I 型吸收帶，在709 cm-1處有D-吡喃葡萄糖的III 型吸收帶，而HRS 均沒有，說明原淀粉經(jīng)處理后D-吡喃結(jié)構(gòu)被破壞。

3.2 器官和脂肪組織質(zhì)量

圖2中顯示了喂養(yǎng)4 周后4 組金黃地鼠器官質(zhì)量和脂肪組織質(zhì)量對(duì)比。與正常對(duì)照組相比，高脂飲食導(dǎo)致肝臟和腎臟質(zhì)量、附睪和腎周脂肪質(zhì)量顯著增加，內(nèi)臟器官的質(zhì)量增加源自于脂肪的大量積累；然而，各組間脾臟質(zhì)量無顯著性差異（P>0.05），表明短時(shí)間內(nèi)高脂或HRS 飲食不會(huì)明

圖1 淀粉的傅里葉變換紅外光譜分析Fig.1 Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）analysis of starches

3.3 血糖和血脂

金黃地鼠的血糖和血脂指標(biāo)對(duì)比如表1。在第4 周結(jié)束時(shí)，與正常對(duì)照組相比，模型組的血糖顯著增加（P<0.05）。這是因?yàn)楦咧澄镎T導(dǎo)的血糖升高與肝臟細(xì)胞的糖原異常增加有關(guān)，在脂肪代謝障礙情況下，肝臟中脂肪積聚減弱，從而減弱了葡萄糖轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)，導(dǎo)致血糖升高[17]。然而，高劑量HRS 干預(yù)后血糖顯著降低至正常水平（P<0.05）。這是因?yàn)榭剐缘矸劭山档痛x速度、調(diào)節(jié)胰島素水平，使高脂飲食誘導(dǎo)的高血糖現(xiàn)象得到抑制[18]。

圖2 4 周末金黃地鼠器官和脂肪組織質(zhì)量Fig.2 Change in organs and adipose tissues weight of golden hamsters over the four week period

由表1還可以看出，與正常對(duì)照組相比，模型顯影響金黃地鼠的免疫系統(tǒng)[14]。與正常對(duì)照組相比，高劑量HRS 顯著降低了肝臟和腎臟質(zhì)量，抑制了由高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織擴(kuò)張，附睪和腎周脂肪質(zhì)量得到有效控制。此結(jié)果與Martinez 等[15]的報(bào)告一致，他們發(fā)現(xiàn)生馬鈴薯抗性淀粉可減少脂肪組織的形成。這是因?yàn)檩^高劑量抗性淀粉食物消化和吸收緩慢，有效減少了脂肪生成[16]。組中TC、TG 和LDL-C 水平顯著升高，HDL-C 顯著降低（P<0.05）；除HDL-C 濃度外，低劑量RS 組與模型組的血脂指標(biāo)無顯著差異（P<0.05）。與模型組相比，高劑量HRS 組的TC、TG 和LDL-C 含量顯著降低，HDL-C 含量顯著升高（P<0.05），表明高劑量HRS 飲食可使高脂血癥明顯減輕。相關(guān)研究證實(shí)，用玉米和高粱制備抗性淀粉亦能夠降低血清膽固醇和血脂水平[19-20]?？赡苁且?yàn)榭剐缘矸劢?jīng)腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，抑制脂肪合成酶活性，調(diào)節(jié)血液與肝臟中膽固醇再分配，從而抑制膽固醇與甘油三脂的合成[21]。

表1 紫山藥抗性淀粉對(duì)金黃地鼠血糖和血脂指標(biāo)影響Table 1 Effect of purple yam resistant starch on the blood glucose and blood lipid parameters in golden hamsters

3.4 盲腸菌群變化

各試驗(yàn)組金黃地鼠盲腸菌群序列的OTU 數(shù)量曲線如圖3a 所示。與第2 周相比，喂養(yǎng)4 周后正常對(duì)照組和高劑量HRS 組盲腸菌群OTU 數(shù)量明顯增加，模型組和低劑量HRS 組OTU 數(shù)量有所減小；特別是與其它各組相比，高劑量HRS 組的OTU 數(shù)量最高。OTU 數(shù)量是菌群相對(duì)豐度分析中的一個(gè)重要參數(shù)[22]。由此可見，高劑量HRS 對(duì)增強(qiáng)金黃地鼠盲腸菌群相對(duì)豐度具有積極作用。

在門水平上，不同組盲腸細(xì)菌的相對(duì)豐度如圖3b 所示?？傮w而言，盲腸細(xì)菌群落主要包括3個(gè)門，其中厚壁菌門（Firmicutes）占主導(dǎo)，其次為擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）。與第2 周相比，第4 周末模型組的擬桿菌數(shù)量顯著減少，厚壁菌門增加，厚壁菌門與擬桿菌的比例增加，有研究表明肥胖小鼠的厚壁菌與擬桿菌的比例明顯高于正常對(duì)照組[2，22]；而空白對(duì)照組和HRS 組擬桿菌門、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門 （Actinobacteria）和浮霉?fàn)罹T（Planctomycetes）相對(duì)豐度增大，而厚壁菌門的相對(duì)豐度減小，尤其以高劑量HRS 組更為明顯，而且相對(duì)豐度亦增大；硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、軟壁菌門（Tenericutes）、綠菌門（Chlorobi）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）等的豐度沒有明顯變化。由此可見，喂食HRS 飼料4 周后，高劑量HRS 導(dǎo)致擬桿菌門、變形菌門與厚壁菌門比例進(jìn)一步增加。

在科水平上，盲腸細(xì)菌類群相對(duì)豐度如圖3c所示。高劑量HRS 組盲腸菌群多樣性較其它組高，而模型組最少。抗性淀粉在腸道發(fā)酵過程中產(chǎn)生許多有益代謝物，可能有助于促進(jìn)有益菌繁殖并增加腸道微生物群多樣性[23]。高劑量HRS 組的細(xì)菌科主要由丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）、擬桿菌科S24-7 組、真桿菌科（Eubacteriaceae）、瘤胃球菌科 （Ruminococcaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）組成。雖然高、低劑量HRS 組細(xì)菌科的構(gòu)成相似，但不同細(xì)菌的豐度存在差異。與2 周相比，HRS 干預(yù)4 周后，盲腸中代表性優(yōu)勢(shì)細(xì)菌[24-25]瘤胃球菌科、毛螺菌科和擬桿菌科S24-7組的豐度增加，而真桿菌科穩(wěn)定。有研究表明，瘤胃球菌對(duì)抗性淀粉的降解起重要作用[26]，有利于能量釋放[17]。作用機(jī)理有待進(jìn)一步探索。

圖3 金黃地鼠盲腸細(xì)菌群落的變化Fig.3 Variation of cecal microbiota in golden hamsters

3.5 盲腸菌群結(jié)構(gòu)分析

一些主要細(xì)菌科水平的變化用熱圖表示 （圖4a），以評(píng)價(jià)其對(duì)細(xì)菌門變化的貢獻(xiàn)。與第2 周相比，用高脂飲食喂養(yǎng)4 周后金黃地鼠盲腸中擬桿菌門的相對(duì)豐度明顯減小，厚壁菌豐度增大，而高劑量RS 組擬桿菌以及相對(duì)豐度增大，厚壁菌門豐度減小。有研究指出，肥胖人群中厚壁菌的比例較正常人群的顯著增加，而擬桿菌門則低于正常人群[40]，這是因?yàn)閿M桿菌門較其它微生物如厚壁菌門需要更廣的碳水化合物底物范圍[16]。高脂飲食可減少腸道中可用碳水化合物量，增加腸道氧應(yīng)激狀態(tài)及其自身的次級(jí)代謝物，從而破壞腸道微生物環(huán)境抑制益生菌的增殖[27-28]。因此，厚壁菌門豐度的減小和擬桿菌門、變形菌門豐度的增大，有效改善了高血脂癥癥狀（見表1）。

圖4 金黃地鼠盲腸菌群結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Structural analysis of cecal microbiota in golden hamsters

分類組成分析（LEfSe 分析）如圖4b 所示。高、低劑量HRS 組喂養(yǎng)4 周與空白對(duì)照組、模型組喂養(yǎng)2 周時(shí)盲腸內(nèi)容物中多個(gè)分類群存在顯著差異。與其它組相比，其中低劑量HRS 干預(yù)4 周時(shí)擬桿菌的豐度高，高劑量HRS 干預(yù)組菌群主要為 瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）和梭菌屬（Clostridia）。

抗性淀粉通過上消化道進(jìn)入下消化道，由細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生重要的代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸，從而改善腸道微生態(tài)環(huán)境[29-30]。因此，食用HRS 可調(diào)節(jié)腸道細(xì)菌構(gòu)成，改善因高脂飲食導(dǎo)致盲腸菌群失衡，進(jìn)而調(diào)節(jié)血脂水平。

4 結(jié)論

1）紫山藥高抗性淀粉可有效減輕高脂血癥金黃地鼠內(nèi)臟的脂肪質(zhì)量，降低血糖值；血液指標(biāo)中TC、TG 和LDL-C 濃度顯著降低，HDL-C 濃度增加。

2）高抗性淀粉干預(yù)4 周后，盲腸中厚壁菌門的數(shù)量減少，擬桿菌門和變形菌門的數(shù)量增加；代表性優(yōu)勢(shì)細(xì)菌瘤胃球菌科、毛螺菌科、擬桿菌科S24-7 組和梭菌屬的豐度增加，有效改善了因高脂飲食導(dǎo)致的盲腸菌群失衡。