于雷雷,周興婷,翟齊嘯*,郭仁妹,崔樹茂,陳 衛(wèi)
(1 江南大學食品學院 江蘇無錫 214122 2 蘇州硒泰克生物科技有限公司 江蘇蘇州215100)
近些年,隨著物質生活的豐富和膳食結構的改變,全世界糖尿病患者的數(shù)量急劇上升。糖尿病主要分為4 種類型,分別為1 型糖尿病、2 型糖尿病、妊娠糖尿病和其它類型糖尿病,其中2 型糖尿病是造成全世界糖尿病患者數(shù)量激增的主要因素[1]。國際衛(wèi)生組織預測2025年患者數(shù)量將突破3 億,中國是世界上糖尿病患者人數(shù)位居第二的國家[2]。目前2 型糖尿病的機理尚不明確,導致發(fā)病的誘因眾多,包括遺傳、環(huán)境、年齡、種族、生活方式等。2 型糖尿病會導致糖尿病腎病、糖尿病眼部并發(fā)癥、糖尿病足、糖尿病心血管和腦血管病等多種并發(fā)癥[3],目前采用的較為普遍的是藥物療法、飲食療法、運動療法和心理干預。藥物療法主要是磺脲類藥物、格列奈類藥物、雙胍類藥物、噻唑烷二酮類藥物和α-糖苷酶抑制劑類藥物。藥物在控制血糖的同時也帶來了不可避免的副作用。研究發(fā)現(xiàn)磺脲類藥物與機體生長激素紊亂、惡性腫瘤和體重增加等不良反應有關[4]。格列奈類藥物通過刺激胰島素的早期分泌而降低餐后血糖達到降糖效果,然而也會加劇低血糖和體重增加的風險。雙胍類藥物會導致惡心、嘔吐、頭暈以及乳酸中毒等不良癥狀[5]。噻唑烷二酮類藥物通過增加靶細胞對胰島素作用的敏感性而降低血糖,體重增加和水腫是該類藥物最常見的副作用。α-糖苷酶抑制劑類藥物最常見的不良反應是胃腸道不適。飲食療法、運動療法和心理干預在一定程度可以預防和改善糖尿病,然而無法替代藥物治療的效果。探尋更安全、有效的降糖方法非常必要。膳食補充劑是指添加了礦物質、維生素及相對功能明確的補充劑等成分的一種復配產(chǎn)品。目前膳食補充劑被廣泛使用,針對不同的適宜人群,有多種多樣的膳食補充劑,例如適合育齡婦女、嬰兒、兒童的膳食補充劑[6],具有減少飲食內毒素血癥功能的益生菌膳食補充劑[7]等,其中益生菌膳食補充劑成為目前研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)與地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌復配的葫蘆巴種子的攝入能夠增加金頭鯛體內超氧化物歧化酶和過氧化氫酶[8];而且益生菌膳食補充劑的攝入有顯著的改善心理亞健康,緩解焦慮和抑郁等癥狀[9]。
乳酸菌屬于益生菌的種類之一,近些年對乳酸菌的研究越來越多。由于益生菌的益生作用和安全性,因此被廣泛應用于發(fā)酵食品。文獻報道,乳酸菌對改善2 型糖尿病的癥狀具有顯著的效果[10-13]。鼠李糖乳桿菌LGG 能夠顯著抑制機體對葡萄糖的吸收,從而降低餐后血糖[10-11]。鼠李糖乳桿菌CRL981 能夠緩解高血糖水平,調節(jié)機體血脂水平和抗氧化酶的活力[12]。羅伊氏乳桿菌GMNL-263 可以明顯改善胰島素抵抗水平,從而改善糖尿病癥狀[13]。而植物乳桿菌X1 和鼠李糖乳桿菌CCFM0528 已在本團隊的前期研究中發(fā)現(xiàn)具有顯著緩解機體炎癥癥狀、改善腸道通透性、降低血糖水平的作用[14-15]。因此,本研究選擇這兩種菌進行深入研究。
鉻是自然界中的一種金屬元素,常見的化合價是二價、三價、六價。同時鉻是人體必需的微量元素之一,在維持人體健康方面有著顯著的作用,人體所需要的鉻是三價鉻[16],美國建議成人每日鉻攝入量為50~200 μg,英國建議成人每日安全攝入量大于25 μg,而我國建議成人每日攝入量為50 μg,最大耐受劑量為200 μg。1959年,科學家成功從啤酒酵母中提取出有機鉻結合蛋白(GTF),GTF 能夠很好地維持機體血糖水平,鉻參與糖代謝,調控胰島素發(fā)揮作用,從而達到降糖的效果[17-19]。鉻同時參與生物體內的脂代謝過程,可以減少脂肪和膽固醇的堆積,促進蛋白質的合成,維持生物體核酸穩(wěn)定[20]。富鉻酵母產(chǎn)品具有降糖效果,能夠明顯緩解糖尿病癥狀,因其效果好和安全性高的特點而被廣泛應用。
本文研究2 株具有顯著降糖效果的乳桿菌——植物乳桿菌 X1 和鼠李糖乳桿菌CCFM0528 與富鉻酵母復配的膳食補充劑,對高脂飼料和STZ 作用下誘導的2 型糖尿病模型的血糖水平、炎癥因子水平、抗氧化水平和糖尿病相關指標的影響,探究其在降糖方面是否有協(xié)同增效作用。
植物乳桿菌(X1)、鼠李糖乳桿菌(CCFM0528),來源于江南大學食品生物中心菌種保藏中心;蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、無水葡萄糖、無水乙酸鈉、七水合硫酸鎂、一水合硫酸錳、檸檬酸氫二鈉、三水合磷酸氫二鉀、吐溫80 等,均購于國藥集團化學試劑有限公司;鹽酸二甲雙胍片,購于中美上海施貴寶制藥有限公司;鏈脲佐菌素(STZ),購于Sigma 公司;高脂飼料(D12492),購于北京華阜康生物科技股份有限公司;富鉻酵母,購于安琪酵母股份有限公司。
小型冷凍離心機,德國Hettich 有限公司;大容量冷凍離心機,美國Beckman 公司;高速冷凍離心機,Eppendorf 公司;隔水式恒溫生物培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司;SW-CJ-1CV 型微生物操作超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;高溫高壓滅菌鍋,日本SANYO 公司;EL204 型電子天平,上海梅特勒-托利多儀器有限公司;血糖儀,臺灣厚美德生物科技股份有限公司。
1.3.1 乳桿菌的活化與培養(yǎng) 從-80 ℃冰箱中取出乳桿菌的保菌管,在乳酸細菌培養(yǎng)基(MRS)固體平板上劃線,挑出單菌落接種到MRS 液體培養(yǎng)基后37 ℃培養(yǎng)18 h,之后以1%~2%的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)18 h,連續(xù)活化3 代后用于后續(xù)試驗。
1.3.2 益生菌復配劑的制備 將活化菌株按1%的接種量接種于1 L 的液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng),37 ℃恒溫下培養(yǎng)18 h 后,在4 ℃,6 000 r/min 的條件下離心10 min 后獲得菌泥,無菌生理鹽水沖洗3 次,用10%的脫脂乳作為保護劑重懸,冷凍干燥后與富鉻酵母進行復配,其中小鼠每日攝入每種乳桿菌含量達到109CFU,富鉻酵母按小鼠每日鉻攝入量100 μg/kg 為標準進行復配。灌胃小鼠之前,用無菌生理鹽水重懸調整菌液濃度為5×109CFU/mL,富硒酵母為5 mg/mL,并在37 ℃水浴中復蘇30 min 后使用。
1.3.3 益生菌復配劑的降糖效果評價試驗
1.3.3.1 動物試驗及適應性喂養(yǎng) 選取50 只體重相似的3 周齡SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠,喂養(yǎng)程序經(jīng)江南大學動物管理和使用委員會的許可(許可證號:JN.No 20180115c0700613[24])。實驗動物房常年恒溫恒濕,保持溫度在(22±2)℃和濕度在(55±5)%的范圍內,并嚴格遵循12 h 晝夜循環(huán)標準。適應性喂養(yǎng)1 周,喂食普通飼料,1 周后隨機分為5 組,分別為空白組、模型組、藥物組、乳酸菌組、復合組。分組后前4 周試驗期間,正常組喂食普通飼料,其余各組喂食高脂飼料,同時正常組、模型組、藥物組灌胃脫脂乳,乳酸菌組喂食混合乳酸菌溶液,復合組喂食膳食補充劑。第5 周,所有小鼠禁食8 h 以上,除正常組外,其余各組小鼠注射新鮮的鏈脲佐菌素STZ(按100 mg/kg 體重注射)。造模1 周后,第6 周模型組開始灌胃鹽酸二甲雙胍(按10 mg/kg 體重灌胃)。試驗第5 周以后所有小鼠喂食普通飼料,同時正常組、模型組、藥物組灌胃脫脂乳,乳酸菌組喂食混合乳酸菌溶液、復合組喂食膳食補充劑。試驗期間定時記錄體重變化以及攝食量。
1.3.3.2 小鼠糖尿病相關指標的測定
1)小鼠體重與攝食量 試驗期間,每周固定時間稱重記錄小鼠體重和攝食量。
2)血糖的測定 試驗期間,每周固定時間測定小鼠的空腹血糖和餐后血糖,測定前,小鼠禁食不禁水8 h,用一次性采血針采取小鼠尾巴血液,用血糖儀進行電化學方法測定空腹血糖,測定結束喂食,在喂食2 h 后測定餐后血糖。
3)口服糖耐量檢測 試驗期間,在造模成功后(第6 周)和動物試驗結束前(第13 周)測定口服糖耐量檢測(OGTT),測定前,小鼠禁食不禁水8 h,檢測血糖(0 min),隨后灌胃葡萄糖溶液(2 g/kg),在15,30,60,90 和120 min 時分別測定血糖。隨后根據(jù)數(shù)據(jù)繪制血糖變化曲線,并計算出糖耐量曲線下面積。
4)采用ELISA 試劑盒測定血清中糖化血紅蛋白(HbA1c)、胰島素、內毒素的含量,以及肝勻漿中的肝糖原含量。
1.3.3.3 小鼠血脂、炎癥因子、氧化應激指標的測定
1)血脂指標 試驗結束后,小鼠禁食處理12 h 后,摘眼球取血,4 ℃,3 000×g 條件下,離心10 min,收集上層血清樣品,存于-80 ℃冰箱中用于后期指標測定。隨后用血液生化儀測定血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)的濃度。
2)炎癥因子 血清存于-80 ℃冰箱中用于測定細胞因子,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素10(IL-10)含量的測定采用ELISA 試劑盒。
3)氧化應激指標 小鼠取血斷頸處死之后,迅速解剖,取出肝臟組織,放于生理鹽水中漂洗干凈后,迅速放入液氮中,后期剪取0.1 g 肝臟放入勻漿EP 管中,加入9 倍質量的生理鹽水,放入組織研磨機中充分研磨,3 000×g 離心15 min 后,吸取上清為肝組織勻漿液,存于-80 ℃冰箱中用于后期指標測定,谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)、總超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)和活性氧(MDA)含量的測定采用ELISA 試劑盒。
試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,采用oneway ANOVA 分析進行數(shù)據(jù)分析,采用Graphpad做圖。
2 型糖尿病小鼠最典型的癥狀就是三多一少,即攝食多、飲水多、排尿多和體重下降[21]。本研究中各組小鼠的體重變化和攝食量結果如表1所示。造模結束后,造模組小鼠出現(xiàn)體重下降、排尿明顯增加的現(xiàn)象,且所有注射STZ 的小鼠均表現(xiàn)出精神萎靡不振、毛發(fā)脫落的癥狀。空白組小鼠的體重明顯高于其它組小鼠(P<0.05),體重增長平均達到11.96 g,而喂食混合乳酸菌和膳食補充劑的小鼠體重下降有所改善,均較模型組有所上升,但并不顯著(P>0.05)。各組小鼠進食量之間沒有顯著性差異,但是模型組攝食量較其它各組均略微偏高(P>0.05)。
2 型糖尿病的模型造模成功的標準為:空腹血糖達到7.0 mmol/L,餐后血糖達到11.0 mmol/L[21]。據(jù)文獻報道[22-24],喂食高脂飼料會使小鼠出現(xiàn)肥胖、高胰島素血癥和胰島素抵抗,而不是明顯的高血糖或糖尿病,注射STZ 后會直接導致胰腺β 細胞被破壞,導致胰島素缺乏而不是胰島素抵抗的后果。動物試驗第5 周通過腹腔注射藥物STZ 來進行2 型糖尿病的模型建立,造模1 周后,測定各組小鼠的血糖值,結果如圖1所示。由圖1a、圖1b可知,在腹腔注射STZ 1 周后,空白組血糖保持在4 mmol/L,其余各組的空腹血糖水平均高于參考值7.0 mmol/L,餐后血糖高于11.0 mmol/L,可以判斷實驗小鼠2 型糖尿病模型造模成功。
表1 小鼠體重及進食變化Table 1 Change in body weight and food intake of mice
整個試驗過程中,每周固定監(jiān)測小鼠的空腹血糖和餐后血糖的變化,結果如圖1c、圖1d 所示。空白組小鼠空腹血糖保持在4 mmol/L,餐后血糖保持在8 mmol/L 的水平上,而造模后發(fā)現(xiàn)造模組小鼠空腹血糖急劇上升,達到9.50 mmol/L,餐后血糖達到了14.94 mmol/L,在后期試驗過程中,造模組小鼠血糖水平有所回升,但空腹血糖保持在8 mmol/L 以上,餐后血糖保持在13 mmol/L 以上,這進一步說明實驗小鼠2 型糖尿病模型造模成功。而試驗結束后藥物組、乳酸菌組、復合組空腹血糖水平分別恢復到了4.4,5.26 和4.66 mmol/L,餐后血糖水平分別恢復到8.50,10.33 和10.30 mmol/L,與模型組有顯著差異(P<0.05),這說明藥物組的治療效果顯著,乳酸菌和富鉻酵母對2 型糖尿病具有緩解效果,其中復合組小鼠緩解血糖效果優(yōu)于乳酸菌組,說明乳酸菌和富鉻酵母對于緩解2 型糖尿病具有一定的協(xié)同增效作用。
圖1 小鼠血糖水平變化Fig.1 Change in blood glucose levels of mice
血糖控制由胰島素和胰高血糖素介導,葡萄糖耐受能力的降低是因為機體代謝糖類物質時存在紊亂,這種紊亂會加劇2 型糖尿病的癥狀,所以監(jiān)測機體的糖耐受能力是判斷和診斷機體是否患有2 型糖尿病的一個重要手段[25]。正常個體在一次性大量攝入葡萄糖后,血糖會短時間出現(xiàn)小幅度升高,約在2 h 后恢復正常血糖狀態(tài),這種屬于糖耐受狀態(tài),2 型糖尿病患者在一次性大量攝入葡萄糖后,血糖會出現(xiàn)急劇上升,而且2 h 內無法恢復到正常水平,并且保持在較高水平。造模成功后及試驗結束前各組小鼠的口服葡萄糖耐量(OCTT)和糖耐量曲線下面積 (AUC)結果如圖2所示。
如圖2a、b 所示,造模成功后(第6 周),灌胃15 min 內,各組小鼠血糖水平均快速上升,但空白組血糖明顯低于其它組,在2 h 后除空白組外血糖維持在較高水平,說明葡萄糖耐受能力明顯降低,符合2 型糖尿病糖耐量降低的特征。乳酸菌組和復合組的AUC 顯著低于模型組,說明乳酸菌組和復合組可以改善糖尿病小鼠的糖耐量。如圖2c、d 所示,試驗結束時(第13 周),空白組的血糖值與前期測量變化不大,糖耐量依然保持平穩(wěn)。藥物組血糖水平接近空白組,說明藥物的治療效果顯著。乳酸菌組和復合組的AUC 值均比模型組顯著降低,說明乳酸菌組和復合組對2 型糖尿病小鼠的糖耐量具有顯著改善作用。Sircana 等[26]也得到相似結果,用LGG、MTCC5689、二甲雙胍或維達列汀治療后的2 型糖尿病小鼠,其AUC 水平明顯降低。因此,喂食乳酸菌和藥物治療能夠使小鼠葡萄糖耐受能力增加。
圖2 小鼠糖耐受性及AUC 葡萄糖Fig.2 OGTT and AUC of all groups
血脂異常是導致2 型糖尿病發(fā)病的重要原因,可以誘導多種并發(fā)癥,如心血管疾病、高血脂等,具有重大危害[26]。所以生活中及時檢測血脂的水平狀態(tài)是保持身體健康的良好習慣,2 型糖尿病患者多伴有混合型血脂異常,其中最主要的變化表現(xiàn)為血漿甘油三酯水平升高,可伴隨血漿總膽固醇水平升高,同時伴有低密度脂蛋白的升高和高密度脂蛋白的降低,檢測機體血脂狀態(tài)能夠直觀地反映其病癥的嚴重程度。試驗結束后各組小鼠血清中血脂含量如表2所示。模型組的血脂水平與空白組有明顯差異(P<0.05),藥物組血脂水平與空白組無明顯差異(P>0.05),說明藥物能夠有效改善糖尿病的癥狀,喂食酵母鉻和乳酸菌后,低密度脂蛋白和甘油三酯水平均有明顯改善(P<0.05),而高密度脂蛋白和甘油三酯的水平與模型組沒有顯著性差異(P>0.05)。文獻報道[27],羅伊氏乳桿菌GMNL-263 能夠明顯降低2 型糖尿病模型小鼠中總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的含量,同時顯著增加高密度脂蛋白含量。
表2 小鼠血清中血脂指標Table 2 Lipid-metabolic parameters in blood serum of mice
高脂飲食可以改變機體的腸道生態(tài)平衡,并且促進炎癥因子的釋放,2 型糖尿病機體體內LPS的含量增加,LPS 可以激活 TLR4/MyD88/NFκB 途徑,釋放炎癥因子[28-30]。這種炎癥級聯(lián)的激活,會導致細胞胰島素抵抗(IR)。細胞因子是反映炎癥水平最直接的指標,TNF-α 是腫瘤細胞因子,可以促進T 細胞產(chǎn)生各種炎癥因子,進而促進炎癥反應的發(fā)生,加劇炎癥水平。IL-10 是抗炎細胞因子,抑制抗原呈遞和炎癥細胞因子的產(chǎn)生。試驗結束時各組小鼠血清中的炎癥因子水平如圖3a、b 所示。模型組小鼠血清TNF-α 與IL-10 水平與空白組小鼠有顯著差異(P<0.05),這進一步證明糖尿病患者體內炎癥水平的異常狀態(tài),而藥物組、復合組和乳酸菌組的TNF-α 水平和IL-10水平均有所恢復,說明酵母鉻和乳酸菌能夠改善2 型糖尿病的炎癥癥狀。據(jù)文獻報道[31],植物乳桿菌OLL2712 可以顯著降低血清中的IL-6 含量和MCP-1 水平,抑制脂肪組織中的慢性炎癥。
圖3 各組小鼠TNF-α、IL-10 炎癥水平Fig.3 Inflammation levels of TNF-α and IL-10 of all groups
據(jù)文獻報道,2 型糖尿病的發(fā)病原因與氧化應激有著緊密的聯(lián)系,宿主可以通過體內的酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)產(chǎn)生自由基,引發(fā)脂質過氧化作用,損傷活細胞,造成胰島組織受損[32-35]。肝勻漿中氧化應激指標的測定結果如表3所示。
表3 小鼠肝勻漿中氧化應激指標Table 3 Oxidative stress parameters in the livers of mice
GSH-Px 是一種清除自由基能力的抗氧化酶,有助于防止脂質過氧化并維持細胞穩(wěn)態(tài)以及氧化還原平衡[36]。造模組小鼠GSH-Px 指標明顯低于其它各組,藥物組、乳酸菌復合組小鼠GSH-Px 水平與空白組小鼠沒有顯著性差異 (P>0.05),與模型組相比恢復明顯(P<0.05),GSH-Px 的降低說明機體清除自由基能力減弱,加劇了炎癥癥狀。據(jù)文獻報道[37],口服嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌能夠增加谷胱甘肽含量。ROS 的產(chǎn)生與抗氧化能力之間相互平衡,在細胞生理學和大腦發(fā)育中起著至關重要的作用,其可在2 型糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機理中起非常重要的作用。本研究結果顯示造模組小鼠ROS 含量明顯上升,而其它組小鼠ROS 含量與正常組持平。據(jù)文獻報道[38],約氏乳桿菌N6.2 可明顯降低其糖尿病小鼠ROS 含量,使其恢復至正常水平。MDA 能夠激活肝內皮細胞和星狀細胞發(fā)揮作用,并且可在肝臟中誘導炎癥和纖維化反應[39]。試驗結果顯示,造模組小鼠MDA 水平明顯升高,而其它組小鼠MDA 水平均較空白組無明顯差異(P>0.05)[40]。上述試驗結果證明在喂食富鉻酵母和乳酸菌之后各組小鼠氧化應激指標均有所改善,說明富鉻酵母、植物乳桿菌X1 和鼠李糖乳桿菌CCFM0528 對緩解2 型糖尿病具有明顯效果,其中富鉻酵母和乳酸菌的復配配方效果更明顯,進一步證明復配配方在降糖方面具有協(xié)同增效作用。
HbA1c 是成人血紅蛋白的一部分,由血紅蛋白和葡萄糖經(jīng)非酶促反應形成,其形成速率與環(huán)境葡萄糖的濃度成正比,所以HbA1c 能夠提供有關近期平均血糖的重要信息,它可以用來作為長期監(jiān)測血糖水平的一個重要指標[41]。胰島分泌胰島素,參與糖代謝和控制血糖平衡,可用于治療糖尿病。內毒素進入機體體內能夠破壞腸道通透性同時加劇機體炎癥水平,加劇糖尿病癥狀,研究發(fā)現(xiàn)2 型糖尿病和血脂異常患者體內LPS 水平明顯高于正常人水平[26,42]。肝糖原是體內的儲能物質,由葡萄糖分子聚合而成,一般以糖原的形式儲存在機體體內,當機體缺乏能量時,可以轉化為能量,提供機體需要[26]。
如表4中所示,模型組HbA1c、胰島素、內毒素和肝糖原的含量與空白組含量相比均有顯著性差異(P<0.05)。復合組和乳酸菌組的HbA1c 的含量比模型組含量分別顯著降低了43.37%和40.8%,并且復合組的HbA1c 與藥物組相比無顯著性差異(P>0.05)。復合組和乳酸組的內毒素含量比模型組含量分別降低了29.9%和21.11%。模型組胰島素和肝糖原水平分別比空白組顯著降低了43.19%和7.4%,復合組和乳酸菌組的胰島素和肝糖原水平較模型組均有所恢復。
表4 小鼠血清中糖基化血紅蛋白、胰島素、內毒素及肝糖原指標Table 4 Serum HbA1c,insulin,endotoxin and glycogen in the livers in mice
將具有緩解2 型糖尿病癥狀的植物乳桿菌X1、鼠李糖乳桿菌CCFM0528 與富鉻酵母進行復配,在高脂飼料和STZ 誘導下的2 型糖尿病模型中評價藥物組、乳酸菌組與復合組的降糖效果。試驗結果表明藥物組具有非常明顯的改善作用,而乳酸菌組與復合組能夠有效緩解血糖水平和口服糖耐量水平,改善機體炎癥水平,部分程度上改善氧化應激水平、相關糖尿病生化水平和血脂水平,達到一定的降糖效果。值得注意的是,富鉻酵母和乳酸菌的混合配方在降糖方面具有協(xié)同增效作用,這為研發(fā)具有緩解2 型糖尿病效果的富鉻酵母益生菌產(chǎn)品提供了堅實的基礎。