李一鳴，陳 華，袁曉燕，郭東風

海軍軍醫(yī)大學附屬公利醫(yī)院，上海 200135 1婦科；2 全科醫(yī)學科

宮頸癌是常見的婦科腫瘤，是全世界女性，尤其是發(fā)展中國家女性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[1]。隨著宮頸癌早期篩查、診斷技術(shù)和治療手段的不斷發(fā)展，近年來宮頸癌的發(fā)病率和死亡率有所降低，但宮頸癌患者的長期預(yù)后仍不容樂觀[2]。微RNA(microRNA，miRNA)是一種小的非蛋白質(zhì)RNA，由19 ～ 25個核苷酸組成，在許多與腫瘤惡性進展密切相關(guān)的生物學過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[3-4]。miR-324-3P與多種惡性腫瘤密切相關(guān)，其可通過多種途徑參與非小細胞肺癌、鼻咽癌和胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，可起到促癌因子的作用，也可起到抑癌因子的作用[5-7]。miR-324-3P在宮頸癌中的表達未見相關(guān)報道。miRNA存在很多靶基因，其主要通過調(diào)控不同的靶基因發(fā)揮不同的生物學功能，如miR-324-3p通過靶向調(diào)控WNT2b在鼻咽癌中發(fā)揮抑癌作用[6]。WNT3a為經(jīng)典的Wnt信號通路中的重要蛋白，與胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，對細胞的分化成熟有重要作用[8]。本研究采用TargetScan7.1軟件預(yù)測miR-324-3P可能的靶基因，分析miR-324-3P及其靶基因在宮頸癌患者組織中的表達情況及其對癌 細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。

材料與方法

1 主要試劑和材料 Trizol試劑、PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix EX TaqTMⅡqRT-PCR試劑盒，日本TaKaRa公司；miR-324-3P、WNT3a、內(nèi)參GAPDH引物，上海生工生物工程有限公司合成；FBS、高糖培養(yǎng)基和胰酶，美國Giboc公司；宮頸癌細胞(HeLa細胞)，美國ATCC細胞庫；過表達WNT3a質(zhì)粒、pGLO-WNT3a-野生型質(zhì)粒(WNT3a-wt)和pGLOWNT3a-突變型質(zhì)粒(WNT3a-mut)，上海吉凱公司；雙熒光素酶報道基因檢測試劑盒，上海碧云天生物試劑有限公司；miR-324-3P mimic，廣州瑞博生物技術(shù)有限公司；MTt試劑，北京索萊寶試劑有限公司；Boyden小室，美國BD公司；Transwell小室，美國Coring公司；RIPA和BCA，美國Thermo公司；WNT3a和β-catenin抗體 ，美國Proteintech公司。

2 宮頸組織來源 選擇2018年1月- 2019年1月入住我院的原發(fā)性宮頸癌患者術(shù)后樣本40例，納入標準：1)術(shù)后經(jīng)病理診斷，確診為宮頸癌；2)患者未接受過任何形式的抗腫瘤治療。排除標準：1)合并其他類型的惡性腫瘤；2)合并有嚴重器質(zhì)性病變；3)不同意參與本次研究。另選取同期我院收治的因子宮疾病切除正常宮頸組織樣本40例。所有患者均對本次研究內(nèi)容知情同意 。所有操作均符合我院倫理委員會要求批件。

3 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)檢測mRNA相對表達量 加入Trizol試劑，依次加入氯仿、異丙醇和乙醇提取RNA。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit配制反應(yīng)體系，85℃ 5 s，37℃ 15 min將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按照SYBR Premix EX TaqTMⅡqRT-PCR配制反應(yīng)體系，95℃ 5 s，40個95℃ 5 s、65℃ 34 s循環(huán)進行PCR擴增，測得各孔循環(huán)閾值(threshold cvcle，Ct)，按照2?ΔΔCt公式以GAPDH為內(nèi)參分別計算miR-324-3P和WNT3a mRNA相對表達量。miR-324-3P引物序列F：5′-ACTGC CCCAGGTGCTGCTGG-3′，R：5′- GCGAGCACAG AATTAATACGAC-3′。WNT3a引物序列F：5′-AGCTACCCGATCTGGTGGTC-3′，R：5′-CAAACTCG ATGTCCTCGCTAC-3′。GAPDH引物序列F：5′- GT GAACCATGAGAAGTATG-3′，R：5′-CGGCCATC A CGCCACAGTTTC-3′。

4 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 宮頸癌細胞(HeLa細胞)復(fù)蘇后重懸至含有10% FBS的高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞融合度為95%左右時，以一傳三進行細胞傳代。細胞長滿時采用胰酶消化，1×105/孔接種至6孔板中，分為對照組(NC組)、miR-324-3P mimic組和miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組。細胞接種12 h后采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，無關(guān)序列轉(zhuǎn)染NC組細胞，miR-324-3P模擬物(mimic)轉(zhuǎn)染miR-324-3P mimic組細胞，miR-324-3P mimic和WNT3a過表達質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染miR-324-3P mimic+o e-WNT3a組細胞，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5 驗證miR-324-3P靶向調(diào)控WNT3a TargetScan 7.1軟件(http://www.targetscan.org)預(yù)測miR-324-3P可能的靶基因。HeLa細胞長滿時采用胰酶消化，2 000/孔接種到96孔板中，分為：NC+WNT3a-wt組；miR-324-3P+WNT3a-wt組；NC+WNT3a-mut組；miR-324-3P+WNT3a-mut組，無關(guān)序列與WNT3a-wt同時轉(zhuǎn)染NC+WNT3a-wt組細胞，miR-324-3P mimic與WNT3a-wt同時轉(zhuǎn)染miR-324-3P+WNT3a-wt組細胞，無關(guān)序列與WNT3a-mut同時轉(zhuǎn)染NC+WNT3a-mut組細胞，miR-324-3P mimic與WNT3a-mut同時轉(zhuǎn)染miR-324-3P+WNT3a-mut組細胞，收集轉(zhuǎn)染48 h時的各組細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢 測各組細胞熒光素酶活性。

6 四 唑 鹽 比 色 法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)實驗檢測細胞增殖能力 HeLa細胞長滿時采用胰酶消化，1 500/孔接種到96孔板中，分為NC組、miR-324-3P mimic組和miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組，按照前文中的細胞轉(zhuǎn)染方法進行轉(zhuǎn)染。在細胞轉(zhuǎn)染48 h時，加入20 μL MTT試劑，培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO試劑溶解晶體。在490 nm處測得各樣品的OD值。細胞增殖率=實驗組OD值/對照組O D值×100%。

7 Boyden實驗檢測細胞侵襲能力 各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化收集，PBS洗3次后，100 μL無血清高糖培養(yǎng)基重懸1×105個細胞，加至Boyden小室上室底部的微孔膜上，然后放入含有500 μL高糖完全培養(yǎng)基的24孔板中，使微孔膜下室面與24孔板中的培養(yǎng)基接觸。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后取出Boyden小室，微孔膜上室面細胞采用PBS洗去后，下室面細胞經(jīng)甲醇固定、結(jié)晶紫染色后，計算 穿膜的細胞數(shù)。

8 Transwell實驗檢測細胞轉(zhuǎn)移能力 各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化收集，PBS洗3后，100 μL無血清高糖培養(yǎng)基重懸1×105個細胞，加至Transwell小室上室底部的微孔膜上，然后放入含有500 μL高糖完全培養(yǎng)基的24孔板中，使微孔膜下室面與24孔板中的培養(yǎng)基接觸。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后取出Transwell小室，微孔膜上室面細胞采用PBS洗去后，下室面細胞經(jīng)甲醇固定、結(jié)晶紫 染色后，計算穿膜的細胞數(shù)。

9 Western-blot法檢測WNT3a、β-catenin等蛋白表達 各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化收集，PBS洗3次，加入RIPA混勻細胞后震蕩裂解30 min，4℃高速離心20 min，將上清蛋白裂解液移至新EP管中，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒獲得各樣品蛋白濃度。蛋白裂解液中加入上樣緩沖液，蛋白進行煮沸變性。上樣行凝膠電泳分離蛋白，濕性轉(zhuǎn)PVDF膜，8%脫脂牛奶孵育PVDF膜，一抗稀釋液WNT3a和β-catenin 4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光法曝光蛋 白條帶。

10 統(tǒng)計學分析 使用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量數(shù)據(jù)均通過正態(tài)性檢驗，以±s 表示，兩組間的比較為成組t檢驗或校正t檢驗(統(tǒng)計量為t)，多組間的比較為單因素方差分析(統(tǒng)計量為F)+兩兩比較LSD-t檢驗(統(tǒng)計量LSD-t)。檢驗水準 α=0.05。

結(jié) 果

1 miR-324-3P對WNT3a的靶向調(diào)控作用 Target Scan 7.1軟件在線預(yù)測顯示，WNT3a啟動子區(qū)與miR-324-3P具有結(jié)合位點(圖1)。雙熒光素酶報告基因試驗結(jié)果顯示：與NC+WNT3a-wt共轉(zhuǎn)染組相比，miR-324-3P+WNT3a-wt共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶 活 性 降 低(1.00±0.05 vs 0.53±0.08，t=12.203，P=0.000)；而NC+WNT3a-mut組與miR-324-3P+WNT3a-mut組間的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(1.00±0.03 vs 0.93±0.15，t=1.121，P=0.289)。與NC組相比，miR-324-3P mimic組中WNT3a mRNA的 表 達 降 低(1.00±0.01 vs 0.43±0.08，t=17.318，P =0.000)。miR-324-3P靶向負調(diào)控WNT3a(圖2)。

2 宮頸癌組織中miR-324-3P和WNT3a的表達水平 miR-324-3P在宮頸癌組織中的相對表達量為0.79±0.39，在宮頸正常組織中為1.00±0.34，與宮頸正常組織相比，宮頸癌組織中miR-324-3P的表達水平下降(t=2.567，P=0.012)，見圖3A。WNT3a mRNA在宮頸癌組織中的相對表達量為1.46±0.53，在宮頸正常組織中為1.00±0.30，與宮頸正常組織相比，宮頸癌組織中WNT3a mRNA的表達水平升高 (t=4.777，P=0.000)，見圖3B。

圖 1 WNT3a啟動子區(qū)與miR-324-3P的結(jié)合位點F ig.1 Binding site of WNT3a promoter region with miR-324-3p

圖 2 miR-324-3P對WNT3a的靶向調(diào)控作用 (aP＜0.05)F ig.2 Targeted regulation of miR-324-3p on WNT3a (aP＜0.05)

3 miR-324-3P與WNT3a在宮頸癌組織中表達的相關(guān)性 Pearson分析結(jié)果顯示，宮頸癌組織中miR-324-3P與WNT3a mRNA表達呈負相關(guān)(r=? 0.503，P=0.000)。

4 miR-324-3P調(diào)控WNT3a對TE1細胞增殖能力的影響 MTT實驗檢測結(jié)果顯示，NC組細胞增殖率為100.14%±6.35%，miR-324-3P mimic組細胞增殖率為28.54%±4.58%，miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細胞增殖率為59.97%±7.48%。與NC組相比，miR-324-3P mimic組和miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細胞增殖能力降低(t=22.401、10.028，P=0.000、0.000)。而 與miR-324-3P mimic組 相比，miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細胞增殖能力增強(t=8.778，P=0.000)，提示W(wǎng)NT3a削弱了miR-324-3P對細胞增殖能力的抑制作用。見圖 4。

圖 3 miR-324-3P(A)、WNT3a(B)在宮頸癌和宮頸正常組織中的表達水平Fig.3 Expression levels of miR-324-3p (A) and WNT3a (B) in cervical cancer and normal cervical tissues

圖 4 miR-324-3P調(diào)控WNT3a對TE1細胞增殖能力的影響(aP＜0.05)Fig.4 Effect of miR-324-3p on proliferation of TE1 cells regulated by WNT3a (aP＜0.05)

5 miR-324-3P調(diào)控WNT3a對TE1細胞侵襲能力的影響 Boyden檢測結(jié)果顯示，NC組穿膜細胞數(shù)為71.33±5.98，miR-324-3P mimic組穿膜細胞數(shù)為25.67±6.55，miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組穿膜細胞數(shù)為49.33±2.85。與NC組相比，miR-324-3P mimic組和miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細胞侵襲能力降低(t=12.610、8.135，P=0.000、0.000)。與miR-324-3P mimic組相比，miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細胞侵襲能力增強(t=8.113，P=0.000)，提示W(wǎng)NT3a削弱了miR-324-3P對細胞侵 襲能力的抑制作用。見圖5。

6 miR-324-3P調(diào)控WNT3a對TE1細胞轉(zhuǎn)移能力的影響 Transwell檢測結(jié)果顯示，NC組穿膜細胞數(shù)為89.67±4.22，miR-324-3P mimic組穿膜細胞數(shù)為40.33±3.84，miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組穿膜細胞數(shù)為63.33±2.88。與NC組相比，miR-324-3P mimic組和miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細胞轉(zhuǎn)移能力降低(t=21.182、12.628，P=0.000、0.000)。與miR-324-3P mimic組相比，miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細胞轉(zhuǎn)移能力增加(t=11.737，P=0.000)，提示W(wǎng)NT3a削弱了miR-324-3P對細胞轉(zhuǎn) 移能力的抑制作用。見圖6。

7 miR-324-3P調(diào)控WNT3a對wnt/β-catenin的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-324-3P mimic組 和 miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細胞中WNT3a和β-catenin蛋白表達降低(P＜0.05)。與miR-324-3P mimic組相比，miR-324-3P mimic+oe-WNT3a組細胞中WNT3a和βcatenin蛋白表達升高(P＜0.05)，提示W(wǎng)NT3a削弱 了miR-324-3P對β-catenin的抑制作用。見圖7。

圖 5 miR-324-3P調(diào)控WNT3a對MKN1細胞侵襲能力的影響(200×)Fig.5 Effect of miR-324-3p on invasion of MKN1 cells under WNT3a regulation (200×)

圖 6 miR-324-3P調(diào)控WNT3a對MKN1細胞轉(zhuǎn)移能力的影響(200×)F i g.6 Effect of miR-324-3p on the metastatic ability of MKN1 cells under WNT3a regulation (200×)

圖 7 miR-324-3P負靶向調(diào)控WNT3a對wnt/β-catenin的影響 (aP＜0.05)F ig.7 Effect of miR-324-3p negative targeting WNT3a on wnt/β-Catenin (aP＜0.05)

討 論

2018年全球約有57萬名女性被診斷出患有宮頸癌，有31萬例左右患者死于宮頸癌[9]。當前的新輔助放療和化療組合對于早期宮頸癌患者具有較好的療效，然而對于晚期宮頸癌患者的治療效果仍然不能令人滿意，轉(zhuǎn)移性晚期宮頸癌患者的5年生存率僅為16.5%[10]。目前宮頸癌具體的發(fā)病機制尚未明確，因此需深入研究宮頸癌發(fā)病的分子機制，為尋找宮頸癌新的治療策略提供參考。

研究發(fā)現(xiàn)miR-324-3p在非小細胞肺癌組織樣本中表達降低，并可與長鏈非編碼RNA LOXL1-AS1影響非小細胞肺癌增殖和侵襲能力[5]。miR-324-3p在鼻咽癌組織中表達下調(diào)，其可通過影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的E-鈣黏蛋白和波形蛋白等生物標志物的表達水平抑制鼻咽癌細胞的遷移和侵襲能力[11]。Sun等[7]報道胃癌組織中miR-324-3p表達增加，并促進了胃癌細胞生長和遷移，抑制細胞的凋亡。miR-324-3p可發(fā)揮促癌和抑癌的雙重作用。研究結(jié)果顯示，與正常宮頸組織相比，宮頸癌組織中miR-324-3p的表達下降。在HeLa細胞中轉(zhuǎn)染miR-324-3p mimic后，MTT、Transwell和Boyden功能實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-324-3p的HeLa細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低，表明低表達的miR-324-3p在宮頸癌組織中有抑癌作用。

報道顯示，在胃癌細胞中miR-324-3p通過抑制Smad4的表達激活Wnt/β-catenin信號通路，進而參與腫瘤的惡性進展[7]。Wnt/β-catenin信號通路是促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要信號途徑，其激活后可增強腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[12-13]。miR-324-3p可靶向調(diào)控WNT2b[6]，WNT2b為Wnt蛋白家族之一，Wnt家族蛋白在啟動Wnt/βcatenin信號通路活化過程中發(fā)揮重要作用[14]。以上文獻提示miR-324-3p可能與Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)，本研究采用TargetScan 7.1軟件在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)WNT3a可能是miR-324-3p的靶基因。WNT3a屬于Wnt蛋白家族之一，在宮頸癌中表達增加，發(fā)揮促癌作用[15]。本研究結(jié)果顯示，WNT3a在宮頸癌組織中表達增加，與已有的研究結(jié)果一致。同時Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，miR-324-3p與WNT3a在宮頸癌組織中表達呈負相關(guān)性，且在過表達miR-324-3p的宮頸癌細胞中WNT3a mRNA的表達降低，結(jié)合雙熒光素酶報道基因試驗結(jié)果表明miR-324-3p可負靶向調(diào)控WNT3a。在過表達miR-324-3p的宮頸癌細胞中過表達WNT3a的功能實驗發(fā)現(xiàn)，WNT3a可以削弱miR-324-3p抑制的宮頸癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，表明miR-324-3p通過靶向WNT3a抑制宮頸癌的惡性進展。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中重要的功能蛋白，通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用促進信號途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)[16-17]。本文Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，WNT3a可部分恢復(fù)過表達miR-324-3p宮頸癌細胞中的β-catenin蛋白，表明miR-324-3p可靶向WNT3a調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路。

綜上所述，miR-324-3p在宮頸癌組織中表達下調(diào)，并靶向WNT3a抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，可能是通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮作用。提高miR-324-3p的表達可能是宮頸癌治療的新策略。