周子薇，鄭曉梅

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，神經(jīng)系統(tǒng)疾病與腦功能實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000

腦卒中已成為我國死亡率第一的疾病，而腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)的發(fā)病率在腦卒中各亞型中居第二，其發(fā)病1個(gè)月的病死率可達(dá)35%～52%，存活患者多數(shù)遺留有神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重危害患者的生命健康[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦出血后首先作出反應(yīng)的細(xì)胞，調(diào)控著腦出血后炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激，在繼發(fā)性腦損傷中扮演著重要角色。蝦青素(astaxanthin，ASX)又稱蝦黃質(zhì)，具有多種生物學(xué)作用：猝滅單線態(tài)氧、清除氧自由基，促使Nrf2與Keap1分解，激活Nrf2蛋白，也可通過直接抑制活性氧產(chǎn)生等參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，還能抑制Caspase3活化和細(xì)胞色素C釋放起到抗凋亡作用等；可透過血腦屏障對腦出血、腦梗死、阿爾茨海默病等疾病發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[2-5]。但鮮有關(guān)于蝦青素對腦出血小膠質(zhì)細(xì)胞影響的研究，本實(shí)驗(yàn)擬建立腦出血大鼠模型，觀察蝦青素對腦出血大鼠模型小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，探討其可能的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 66只SPF級8周齡健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，許可證編號(hào)SYXK(川)2018-065，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；蝦青素(A832359-25 mg)購于Macklin公司，ELISA試劑盒購于ELK Biotechnology公司；RIPA總蛋白裂解液(AS1004)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(AS1086)、一抗Iba-1(ab178847)GAPDH(ab37168)購于Abcam公司、NF-κB(#8242)購于CST公司、二抗HRP-Goat anti Rabbit(AS1107)購于ASPEN公司、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(AS1059)均購自ASPEN公司；立體定向儀(上海玉研科學(xué)儀器有限 公司)，電泳儀(北京市六一儀器廠)等。

2 腦出血造模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，術(shù)前禁食8 h，常規(guī)稱重、6%水合氯醛麻醉。將大鼠固定在腦立體定位儀，暴露顱骨前囟及冠狀縫，以前囟為中心，向后0.2 mm，右側(cè)旁開3 mm，定位右側(cè)尾狀核，向下鉆孔6 mm，從鼠尾靜脈取血50 μL緩慢注血，第1次勻速注血20 μL，第2次注血30 μL，后緩慢拔針、縫合切口，待大鼠蘇醒后回籠繼續(xù)飼養(yǎng)[6]。造模2 h后進(jìn)行Longa評分，1～3分視為造模成功[7]；假手術(shù)組同樣禁食、麻醉、定位，步驟 同前，但注射等量0.9%氯化鈉注射液，不注血。

3 分組及給藥 以隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、腦出血組、蝦青素低劑量組、蝦青素高劑量組，每組16只。蝦青素低、高劑量組大鼠每天分別予以蝦青素20 mg/kg、40 mg/kg灌胃[8]；假手術(shù)組、腦出血組則給予等體積花生油溶劑灌胃；第3天根據(jù)Garcia法評判各組大鼠神經(jīng)受損程度，最高分18分，評分越低表示神經(jīng)功能障礙越 嚴(yán)重[9]，評分后處死大鼠取腦組織行相關(guān)檢查。

4 大鼠腦組織含水量測定 采用干濕重法計(jì)算腦組織含水量，隨機(jī)選取每組4只大鼠，稱重、麻醉后斷頭取腦組織，吸取腦組織表面血漬，稱取濕重后放進(jìn)100℃烘箱烘24 h后稱干重[6]。含水量 =(濕重 ? 干重)/ 濕重×100%。

5 大鼠腦組織HE染色 隨機(jī)選取每組6只大鼠，常規(guī)稱重、過量麻醉，充分暴露心臟、固定灌注針；右心耳處剪一個(gè)小口，快速灌注0.9%氯化鈉注射液直至右心房流出清亮液體后，用4%多聚甲醛灌注直至大鼠上半身僵硬，迅速斷頭取腦，于視交叉后1 mm處冠狀位向后取腦組織。甲醛固定、石蠟包埋、HE染色，普通光學(xué)顯微鏡(200×)下觀察腦組織病理學(xué)改變，使用Olympus c ellSens Standard顯微鏡圖像軟件采集圖像。

6 免疫熒光觀察小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài) 石蠟切片脫蠟、PBS反復(fù)漂洗、修復(fù)、PBS漂洗、孵育、漂洗、加封閉液、去除封閉液加一抗Iba-1，PBS洗3次后去除PBS加二抗孵育，PBS漂洗，在熒光顯 微鏡下(400×)觀察小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。

7 酶聯(lián)免疫吸附測定腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β表達(dá)水平 處死剩余大鼠，取部分腦組織，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟操作測定腦組織腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白 細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)表達(dá)水平。

8 Western blot檢測Iba-1、NF-κB 取剩余凍存的腦組織塊，用預(yù)冷PBS緩沖液漂洗3次，加入蛋白提取試劑，冰浴制成勻漿，離心收集上清液，用BCA測定蛋白濃度，制膠、上樣、轉(zhuǎn)膜、封閉，除去封閉液，加入一抗Iba-1、NF-κB 4℃過夜，TBST漂洗3次，加二抗孵育，再用TBST漂洗，滴加增強(qiáng)型發(fā)光試劑(ECL)顯色、曝光、顯影、定影，保存膠片。使用AlphaEaseFC軟件以目 的條帶灰度值 /GAPDH灰度值分析蛋白。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。觀測資料主要為符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，以 xˉ±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn) 。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 造模后評分 本實(shí)驗(yàn)過程中1只大鼠在造模過程中因呼吸抑制死亡，1只大鼠在造模后第1天因腦疝死亡，按照動(dòng)物納入標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行大鼠補(bǔ)充，共造 模66只，最終成功造模64只，評分1～3分。

2 給藥后各組大鼠神經(jīng)功能評分 各組大鼠在給藥后第3天進(jìn)行神經(jīng)功能評分，與假手術(shù)組(17.44±0.89)比較，腦出血組大鼠(7.56±1.55)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，評分明顯低于假手術(shù)組(P＜0.05)；與腦出血組(7.56±1.55)比較，蝦青素低劑量組(9.5±1.46)、高劑量組(10.75±1.69)神經(jīng)功能缺損癥狀得到改善，神經(jīng)功能評分均高于腦出血組(P＜0 .05)，且高劑量組改善更明顯(P＜0.05)。見圖1。

3 各 組 大 鼠 腦 組 織 含 水 量 比 較 與 假 手 術(shù)組(77.72%±0.89%)比較，腦出血組(84.60%±0.90%)腦組織含水量增高(P＜0.05)；與腦出血組(84.60%±0.90%)比較，蝦青素低劑量組(82.43%±0.52%)、高劑量組(81.04%±0.98%)腦組織含水量均降低(P＜0.05)，蝦青素高劑量組降低更明顯( P＜0.05)。見圖2。

4 各組大鼠腦組織病理學(xué)改變 假手術(shù)組腦組織無出血灶，細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常；與假手術(shù)組相比，腦出血組可見大量紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞浸潤，周圍細(xì)胞核固縮、溶解、壞死，組織排列紊亂；與腦出血組相比，蝦青素高劑量組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)致密，排列整齊，血腫面積變小，血腫周圍可見少量紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞聚集，蝦青素低劑量組介 于二者之間。見圖3。

圖 1 各組大鼠神經(jīng)功能評分(n=16， x ˉ±s )aP＜0.001，vs假手術(shù)組；bP＜0.001，vs腦出血組；cP=0.016，vs蝦青素低劑量組；F=143.70Fig.1 Neurological severity scores of different groups (n=16， ±s )aP＜0.001, vs sham-operation group; bP＜0.001, vs ICH group;cP=0.016, vs ASX low dose group; F=143.70

圖 2 各組大鼠腦組織含水量比較(n=4， x ˉ±s )aP＜0.001， vs假手術(shù)組；bP=0.003，vs腦出血組； cP=0.038，vs蝦青素低劑量組；F=46.77Fig.2 Comparison of brain water content in each group (n=4, ±s )aP＜0.001, vs sham-operation group; bP=0.003, vs ICH group; cP=0.038, vs ASX low dose group; F=46.77

5 免疫熒光觀察各組大鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞 假手術(shù)組的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量少，胞體小，突起及分支細(xì)長，處于“靜息狀態(tài)”；與假手術(shù)組相比，腦出血組可見活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，并且形態(tài)學(xué)呈“阿米巴樣改變”：胞體明顯變大變圓，分支減少，突起變得短粗。與腦出血組相比，蝦青素治療組小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)也趨向靜息狀態(tài)改變：胞體 明顯變小，分支逐漸細(xì)長。見圖4。

6 各組大鼠腦組織炎性因子TNF-α、IL-1β表達(dá)水平 與假手術(shù)組比較，腦出血組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.05)；與腦出血組比較，蝦青素低、高劑量組大鼠腦組織TNFα、IL-1β表達(dá)水平均下降(P＜0.05)，蝦青素高劑量 組下降程度更明顯(P＜0.05)。見表1。

圖 3 各組大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)(HE染色，200 × )F ig.3 Comparison of pathological. Results between different groups (HE staining, 200 × )

圖 4 各組大鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)(免疫熒光，400×)F ig.4 Expression of microglial cell in brain tissue of each group (IF, 400×)

7 Western blot法測各組大鼠腦組織Iba-1、NFκB蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組(0.108±0.010，0.092±0.020)比較，腦出血組(0.463±0.044，0.595±0.028)腦組織中Iba-1、NF-κB蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)；與腦出血組比較，蝦青素低劑量組(0.321±0.025，0.479±0.03)、高 劑 量 組(0.242±0.016，0.387±0.031)大鼠腦組織中Iba-1、NF-κB蛋白表達(dá)均下調(diào)(P＜0.05)，蝦青素高劑量組下調(diào)更明顯(P ＜0 .05)。見圖5。

表 1 各組大鼠腦組織炎性因子TNF-α、IL-1β表達(dá)水平比較(n=6, ±s )Tab. 1 Expression of TNF-α, IL-1β in brain tissue of each group (n=6, x ˉ±s )

表 1 各組大鼠腦組織炎性因子TNF-α、IL-1β表達(dá)水平比較(n=6, ±s )Tab. 1 Expression of TNF-α, IL-1β in brain tissue of each group (n=6, x ˉ±s )

aP＜0.001, vs sham-operation group; bP＜0.001, vs ICH group;cP＜0.05, vs ASX low dose group.

圖 5 各組大鼠腦組織Iba-1、NF-κ B蛋白表達(dá)(n=6， x ˉ±s ) (aP＜0.05， vs假手術(shù)組；bP＜0.05，vs腦出血組； cP＜0.05，vs蝦青素低劑量組)Fig.5 Expression of Iba-1 and NF-κ B protein in brain tissue of each group (n=6, ±s ) (aP＜0.05, vs sham-operation group; bP＜0.05, vs ICH group; cP＜0.05, vs ASX low dose group)

討 論

腦出血是指原發(fā)于腦實(shí)質(zhì)的非外傷性出血，具有較高的致殘率和死亡率，給患者家庭及社會(huì)帶來了巨大的挑戰(zhàn)。當(dāng)前治療腦出血的有效藥物較少，尋求一種可改善生存質(zhì)量的新型藥物是目前研究的難點(diǎn)。Balietti等[10]發(fā)現(xiàn)蝦青素可抑制小鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低活性氧水平，抑制MMP和細(xì)胞毒性等[11]，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，越來越多研究發(fā)現(xiàn)蝦青素對腦出血性疾病具有神經(jīng)保護(hù)作用。何洋等[12]發(fā)現(xiàn)，蝦青素可抑制小鼠腦出血后炎性因子的釋放，近期研究發(fā)現(xiàn)在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型中蝦青素可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減輕炎癥反應(yīng)等從而保護(hù)腦組織[13-14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦出血組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，腦組織含水量顯著增加，而蝦青素低、高劑量組神經(jīng)功能評分、腦組織含水量均得到改善，且呈劑量依賴性，同樣證實(shí)了蝦青素對腦出血具有神經(jīng)保護(hù)作用。

繼發(fā)性腦損傷的嚴(yán)重程度被認(rèn)為是腦出血患者能否存活的關(guān)鍵，而炎癥反應(yīng)是造成腦出血后繼發(fā)性腦損傷的重要環(huán)節(jié)。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦組織中主要的免疫細(xì)胞，具有吞噬、炎癥調(diào)節(jié)、抗原遞呈等作用，參與了繼發(fā)性腦損傷病理生理過程。其正常情況下處于休眠狀態(tài)，起到免疫監(jiān)視的作用，腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞迅速激活為M1型和M2型，M1型可以釋放大量的自由基、炎性因子等；M2型可以分泌IL-4、TNF-β等抗炎因子發(fā)揮“清道夫”作用，吞噬細(xì)胞碎片，其活化狀態(tài)與腦內(nèi)環(huán)境變化的嚴(yán)重程度、作用時(shí)間長短等均相關(guān)，也可隨著機(jī)體的應(yīng)激狀態(tài)而改變[15-16]。研究表明，在腦出血后早期小膠質(zhì)細(xì)胞可加劇腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等，而敲除小膠質(zhì)細(xì)胞后腦水腫程度及神經(jīng)缺損癥狀均可得到有效改善[17-18]。這說明小膠質(zhì)細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒性的雙面作用，在腦出血急性期M2型作用微弱，更多是M1型起主導(dǎo)作用。離子鈣接頭蛋白1在腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，是其特異性標(biāo)志物，故本實(shí)驗(yàn)通過觀察Iba-1免疫標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞的改變，發(fā)現(xiàn)正常大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量少，腦出血大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞被激活，胞體呈“阿米巴樣改變”，HE染色提示組織排列紊亂，大量炎癥細(xì)胞浸潤；且通過蛋白質(zhì)印跡法檢測亦發(fā)現(xiàn)腦出血大鼠較正常大鼠腦組織Iba-1蛋白表達(dá)增高，均提示腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞活化在腦出血中扮演重要角色，而蝦青素低、高劑量組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)向靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變，Iba-1蛋白表達(dá)下降，HE染色提示炎癥細(xì)胞浸潤減少，說明蝦青素可能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化減輕腦出血大鼠腦損傷程度，但其作用機(jī)制需進(jìn)一步探討。

有研究提示，LPS誘導(dǎo)極化小膠質(zhì)細(xì)胞的機(jī)制可能是LPS促進(jìn)BV2細(xì)胞內(nèi)的NF-κB核轉(zhuǎn)位，使其表達(dá)增加[19]。NF-κB存在于神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞中，可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，活化的NF-κB可促進(jìn)下游TNF-α、IL-1β分泌，對炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用[20]。TNF-α、IL-1β是造成腦細(xì)胞水腫的重要因子，也能誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡，還可觸發(fā)黏附分子、趨化因子等釋放，正反饋?zhàn)饔糜贜F-κB，形成惡性循環(huán)，加重炎癥反應(yīng)及細(xì)胞毒性腦損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦出血大鼠腦組織中炎性因子TNFα、IL-1β、NF-κB表達(dá)水平明顯增加，腦組織含水量增加，而蝦青素低、高劑量組均可下調(diào)TNFα、IL-1β、NF-κB的表達(dá)水平，高劑量組更明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明蝦青素可能通過抑制NF-κB活性，減少其下游炎性因子TNF-α、IL-1β等釋放，改善了腦出血后炎性反應(yīng)。近期文獻(xiàn)提示，蝦青素可抑制NF-κB通路活性，減輕大腦炎癥反應(yīng)[21-22]，在體外實(shí)驗(yàn)中亦可通過作用于NF-κB通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞向M1極化[23]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，故我們推測蝦青素可抑制腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞活化，其機(jī)制可能與抑制其胞內(nèi)NF-κB激活有關(guān)。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥反應(yīng)在腦出血的病理生理中起重要作用，而蝦青素可能作用于NF-κB通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減輕炎癥反應(yīng)，對腦出血大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其具體作用靶點(diǎn)仍有待研究。