褚夢(mèng)寒 陳亞男

(揚(yáng)州大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州225000)

0引言

近年來(lái)，玉米種植面積逐步減少，社會(huì)發(fā)展所需的玉米急劇增加，通過(guò)培育玉米耐密新品種增加種植密度提高單位面積產(chǎn)量增加總產(chǎn)從而滿足社會(huì)需求。玉米葉夾角等葉片性狀決定了葉片的空間分布狀態(tài)，對(duì)玉米的耐密性具有重要影響。已有文章證實(shí)[1-2]，玉米葉片面積以及葉夾角決定了玉米作物所獲得的光和有效輻射，進(jìn)而可以影響以玉米樹(shù)冠層的光合作用[3]。葉夾角角度減小，增大葉片中脈與地表面的夾角，可以有效改善玉米群體植株中下部的光照條件，提高玉米植株群體密度，在單位面積內(nèi)可以種植更多的群體，最終達(dá)到增加產(chǎn)量的效果[4]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)了玉米lg1基因可能參與玉米葉夾角形態(tài)的建成，通過(guò)對(duì)348份自交系、68份地方品種和32份大芻草的lg1基因重測(cè)序，分析lg1基因的核苷酸多態(tài)性；對(duì)自交系葉夾角表型與lg1基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，檢測(cè)與葉夾角性狀相關(guān)的優(yōu)異變異位點(diǎn)和單倍型，探究lg1基因在玉米馴化和改良過(guò)程中的作用。

1材料和方法

1.1供試材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試材料包含348份玉米自交系、68份玉米地方品種以及32份大芻草。種植田間試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，雙行種植，設(shè)置2個(gè)區(qū)組重復(fù)，標(biāo)準(zhǔn)化田間管理，本研究對(duì)上述3個(gè)環(huán)境下的348份玉米自交系的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行了大田鑒定用于開(kāi)展候選基因關(guān)聯(lián)分析。

1.2DNA提取和lg1重測(cè)序

本實(shí)驗(yàn)利用玉米幼葉使用CTAB法從葉片中提取基因組DNA。華大基因生命科技有限公司在NimbleGen平臺(tái)上使用靶向序列捕獲技術(shù)對(duì)lg1基因進(jìn)行測(cè)序[5]，為了涵蓋基因的5′-非翻譯區(qū)(UTR)和3′-UTR區(qū)段，同時(shí)對(duì)基因啟動(dòng)子前約1500bp和終止密碼子后約500bp進(jìn)行測(cè)序。以來(lái)自B73(RefGen_v3)中的lg1(GRMZM2G36297)基因組序列作為參考，使用MAFFT軟件對(duì)捕獲靶序列進(jìn)行比對(duì)[6]。

1.3基因型數(shù)據(jù)分析、遺傳多樣性分析和中性進(jìn)化檢驗(yàn)

使用BioEdit軟件對(duì)獲得的序列進(jìn)行手動(dòng)編輯?；?′-UTR、3′-UTR、編碼區(qū)和內(nèi)含子參照該基因B73(RefGen_v3)進(jìn)行注釋。采用DNASP6.0軟件進(jìn)行序列多態(tài)性、遺傳多樣性分析和中性進(jìn)化檢驗(yàn)[7-8]。并以此來(lái)衡量多態(tài)性位點(diǎn)間的LD水平。使用TASSEL5.0軟件計(jì)算基因序列上多態(tài)性位點(diǎn)的連鎖不平衡參數(shù)r2，并以此來(lái)衡量多態(tài)性位點(diǎn)間的LD水平。

1.4lg1與玉米自交系中葉夾角性狀的關(guān)聯(lián)分析

利用TASSEL5.0軟件結(jié)合群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，共選取了530個(gè)等位基因頻率(MAF)>0.05的標(biāo)記，采用混合線性模型(MLM)進(jìn)行供試自交系根系表型和基因型的關(guān)聯(lián)分析，顯著p值閾值設(shè)為0.0018(1/530，-log10(p)>2.74)。

2結(jié)果與分析

2.1lg1基因序列變異

lg1基因在不同群體間的核苷酸多態(tài)性。

以玉米參考基因組B73(RefGen_v3)的lg1基因序列為參考模板，在348份玉米材料中定點(diǎn)捕獲到該基因序列全長(zhǎng)。利用ClustalX軟件對(duì)lg1基因序列進(jìn)行多重比對(duì)以及人工校對(duì)?；蛐蛄斜葘?duì)完成后，利用DnaSP 6.0軟件對(duì)lg1基因的序列變異進(jìn)行分析，如表1所示。該基因序列包含了9個(gè)區(qū)段，共測(cè)序了lg1基因6305 bp的基因組區(qū)域，在地方品種和大芻草中，lg1的序列表現(xiàn)出相似的保守性(CL=0.936，CT=0.910)。在自交系中該基因的保守性比其他兩個(gè)群體較高(CI=0.740)。就核苷酸多態(tài)性而言，大芻草的核苷酸多態(tài)性最高，地方品種的多態(tài)性略低于自交系(π*1000T=10.47，π*1000L=17.19，π*1000I=32.85)。本研究分別計(jì)算了3個(gè)群體內(nèi)lg1基因的Tajima’sD值、Fu and Li’sD*和Fu and Li’sF*值，在大芻草中Fu and Li’sD*達(dá)到了顯著水平，而Tajima’s D和Fu and Li’sF*均未達(dá)到顯著水平(表1)，說(shuō)明lg1在大芻草中可能在一定程度上偏離了中性進(jìn)化，但在地方品種和自交系群體內(nèi)符合中性進(jìn)化。

表1 自交系、地方品種和大芻草的核苷酸多態(tài)性分析

2.2lg1與葉夾角性狀的單倍型分析

7個(gè)顯著標(biāo)記均位于基因啟動(dòng)子區(qū)段區(qū)段，其中包含4個(gè)SNP位點(diǎn)，3個(gè)Indel位點(diǎn)。貢獻(xiàn)率在4.67% ～ 6.78%之間(表2)。基于7個(gè)變異位點(diǎn)(SNP/Indel)與LA(葉夾角)顯著關(guān)聯(lián)(圖2a)，連鎖不平衡分析結(jié)果表明，SNP-881與SNP-884位點(diǎn)之間處于完全強(qiáng)連鎖位點(diǎn)，SNP-1175與SNP-1176位點(diǎn)之間也是完全強(qiáng)連鎖位點(diǎn)，InDel-1133、InDel-1136、InDel-1137三個(gè)位點(diǎn)也處于較強(qiáng)的連鎖不平衡(2b)。基于這7個(gè)顯著位點(diǎn)可以將自交系劃分為3種主要單倍型(圖2c)，方差分析結(jié)果顯示Hap1與Hap2間的LA達(dá)到了極顯著差異(P=7.69e-03)，Hap2與Hap3間的LA達(dá)到了極顯著差異，而Hap1與 Hap3兩兩之間不存在顯著差異。分析了SNP-1176在自交系、地方品種和大芻草中的等位基因頻率發(fā)現(xiàn)，在大芻草和地方品種中等位基因頻率小于自交系中等位基因頻率(圖2d)，表明了SNP-1176在馴化過(guò)程中可能受到了選擇。

表2 lg1與葉夾角性狀關(guān)聯(lián)的顯著標(biāo)記

3結(jié)論與討論

玉米基因組中存在大量的變異，常見(jiàn)的變異類型包括SNP和Indel[9]。本研究發(fā)現(xiàn)lg1的非編碼區(qū)核苷酸多態(tài)性較高，存在豐富的自然變異位點(diǎn)，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示顯著位點(diǎn)均位于基因上游區(qū)段。眾多研究表明，植物基因上游區(qū)段的變異可能會(huì)影響基因的表達(dá)或引起部分表型的變化，如張君等文章表明該ZmCLA4基因在2個(gè)親本間的基因片段中有插入和缺失，通過(guò)關(guān)聯(lián)分析，證明該基因與葉夾角顯著關(guān)聯(lián)，通過(guò)驗(yàn)證該基因的表達(dá)能力，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)量與葉夾角大小呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，從而使葉夾角增大。

圖2lg1的自然變異與LA顯著關(guān)聯(lián)。(a)基于lg1與LA的關(guān)聯(lián)作圖；(b)與LA顯著關(guān)聯(lián)的7個(gè)變異位點(diǎn)的LD熱圖；(c)不同單倍型間的LA的比較；(d)SNP-1176在不同群體中的等位基因頻率

玉米葉夾角是理想株型的重要形態(tài)指標(biāo)之一，是在選育玉米品種以及實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)中關(guān)注的重要性狀。本研究在lg1上游同樣發(fā)現(xiàn)了與玉米葉夾角性狀的自然變異，其變異位點(diǎn)的分布、葉夾角性狀的基因?qū)用媛?lián)系等信息，是葉夾角形狀相關(guān)基因的變異及其功能表達(dá)等研究的重要線索。