張 成，廖文敏，薛 鳴，陳 迪，侯巨梅，劉 銅*

（1.海南省綠色農(nóng)用生物制劑創(chuàng)制工程研究中心（海南大學(xué)），?？?570228；2.海南大學(xué)植物保護學(xué)院，?？?570228；3.貴州益百億生物科技有限公司海口研發(fā)中心，?？?570100）

木霉菌Trichodermaspp.廣泛存在于土壤、森林、植株根際或葉面、樹皮及枯枝落葉中，是一種重要的生防真菌[1]。木霉菌不僅可以通過競爭、重寄生和分泌次生代謝產(chǎn)物等方式抑制多種植物病原菌的生長，而且可以通過產(chǎn)生某些植物生長激素物質(zhì)促進作物的生長[2-4]。由于木霉菌對環(huán)境安全，對農(nóng)產(chǎn)品無污染，因此在綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣泛。

目前，已知的木霉菌有250余種[5]，其中以哈茨木霉Trichodermaharzianum、深綠木霉Trichoderma atroviride和綠色木霉Trichodermavirens等作為生防制劑應(yīng)用最為廣泛。最近研究發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉不僅對植物病害有較好預(yù)防作用，并且對作物生長等方面有明顯的效果。如覃柳燕等[6,7]鑒定的棘孢木霉 PZ6能提高香蕉苗根系活力及蕉葉SOD和CAT活性，并能夠在一定程度上增強其對枯萎病菌的防御能力。劉明鑫等[8]發(fā)現(xiàn)棘孢木霉可顯著促進黃瓜根系生長，并能有效防治立枯病。姜傳英等[9]發(fā)現(xiàn)棘孢木霉可以有效提高山新楊的光合能力，促進山新楊幼苗生長。張宏祥等[10]研究發(fā)現(xiàn)棘孢木霉可在砷污染的土壤上緩解砷對小油菜的脅迫，并促進小油菜的生長。因此，棘孢木霉在綠色農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用中具有潛在開發(fā)價值，但是目前國內(nèi)利用棘孢木霉生產(chǎn)的生物制劑鮮有報道。

課題組在前期研究過程中發(fā)現(xiàn)一株具有較強抑菌促生作用的棘孢木霉DQ-1[11]。為了更好地利用和開發(fā)該菌株，本研究擬通過篩選和優(yōu)化棘孢木霉DQ-1分生孢子固體發(fā)酵基質(zhì)和條件，以期探明較高產(chǎn)孢量的棘孢木霉DQ-1固體發(fā)酵條件；并通過盆栽試驗，研究其分生孢子粉對黃瓜、辣椒、番茄和西瓜幼苗生長的影響，為棘孢木霉 DQ-1分生孢子制劑開發(fā)及其在蔬菜作物上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試生防菌棘孢木霉Trichoderma.asperellumDQ-1由海南大學(xué)植物保護學(xué)院木霉菌研究中心提供。PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL），固體發(fā)酵基質(zhì)（麥麩、玉米粉、甘蔗渣、稻殼、水稻秸稈、硅藻土）。供試作物黃瓜“津豐A108”（海南晨鋒種業(yè)有限公司），辣椒“熱辣4號”（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所選育），番茄“千禧”（農(nóng)友種苗有限公司），西瓜“黑美人”（農(nóng)友種苗有限公司）。

供試盆栽基質(zhì)（廣州市生升農(nóng)業(yè)有限公司）主要成分由椰糠、泥炭和炭化稻谷殼組成，堿解氮含量為112.81 mg/kg，有效磷含量為48.06 mg/kg，速效鉀含量為374.95 mg/kg，有機質(zhì)含量為2.93%，pH 7.52。

1.2 試驗方法

1.2.1 木霉菌分生孢子懸浮液制備 將棘孢木霉DQ-1從保存管中接種于PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d后在平板上加入滅菌水，用無菌接種環(huán)適當(dāng)刮洗，在顯微鏡下用血球計數(shù)板測定孢子含量，重復(fù)3次[12]，制成含量為1×108CFU/mL的孢子懸浮液備用。

1.2.2 不同固體基質(zhì)對棘孢木霉DQ-1產(chǎn)孢影響 將麥麩、玉米粉、粉碎后的甘蔗渣、稻殼、水稻秸稈（剪成3～5 cm）5種原料分別加入45%水后拌勻，各自稱取20 g裝于底面直徑為70 mm、容積為200 mL的圓柱形組培瓶中，121 ℃高壓滅菌20 min。待組培瓶冷卻至室溫，按0.5%的接種量（1×108CFU/mL的孢子懸浮液）接種到組培瓶中搖勻，放置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每2 d取出搖勻一次，斷續(xù)培養(yǎng)5 d后取出。稱取1 g發(fā)酵基質(zhì)，以滅菌水稀釋1000倍，用血球計數(shù)板法測量每克基質(zhì)中的產(chǎn)孢量，試驗重復(fù)3次。

1.2.3 不同比例的固體發(fā)酵基質(zhì)正交試驗 將單一發(fā)酵基質(zhì)產(chǎn)孢量最優(yōu)的3種原料麥麩、玉米碎粉、稻殼與硅藻土按照6.8:1:1.2:1的配比，總質(zhì)量為20 g，含水量為45%裝入培養(yǎng)瓶中混勻，作為固體發(fā)酵培養(yǎng)基。這4種成分作為正交試驗的4個因素，每個因素設(shè)不同質(zhì)量比例的3個水平，進行四因素三水平正交試驗，共設(shè)計9個試驗組（表1）。每個試驗組重復(fù)3次，發(fā)酵方法和孢子含量測定方法與1.2.2相同。

表1 固體發(fā)酵正交試驗設(shè)計(L943)Table 1 Design of orthogonal test for solid fermentation

1.2.4 接種方式、接種量及發(fā)酵時間對棘孢木霉DQ-1產(chǎn)孢的影響 采用固體（以純麥麩發(fā)酵完成的木霉菌做固體發(fā)酵種子）和液體（1.2.1孢子懸浮液）接種方式，分別按0.5%、1%、2%、3%、4%質(zhì)量接種量接種到麥麩:玉米碎粉:稻殼:硅藻土配比為6.8:1:1.2:1的固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，每隔2 d取一次樣品，用血球計數(shù)板測量孢子數(shù)，一直到第20 d。發(fā)酵方法和孢子含量測定方法與1.2.2相同，試驗重復(fù)3次。

1.2.5 水稻秸稈代替稻殼對棘孢木霉DQ-1產(chǎn)孢量的影響 在單一基質(zhì)中剪成段的秸稈（3～5 cm）產(chǎn)孢量較低，可能與秸稈長度有關(guān)，現(xiàn)將水稻秸稈分別剪成3、2、1 cm和用粉碎機打碎，將這4種經(jīng)過不同處理方式的秸稈替代固體發(fā)酵基質(zhì)中的稻殼，即麥麩:玉米碎粉:水稻秸稈:硅藻土＝6.8:1.0:1.2:1.0作為試驗組，以發(fā)酵基質(zhì)麥麩、玉米碎粉、稻殼、硅藻土配比為6.8:1.0:1.2:1.0作為對照組，比較稻殼和秸稈對棘孢木霉產(chǎn)孢的影響。每瓶裝料20 g，于121 ℃高壓滅菌20 min。發(fā)酵條件和產(chǎn)孢含量統(tǒng)計方法與1.2.2相同，試驗重復(fù)3次。

1.2.6 淺盤固體發(fā)酵擴大培養(yǎng)及孢子粉的制備 在優(yōu)化培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，利用淺盤固體發(fā)酵的方式將棘孢木霉DQ-1進行擴大培養(yǎng)，以滿足批量生產(chǎn)的需求。先將培養(yǎng)基（麥麩、玉米粉、稻殼、硅藻土比例為5.8:0.5:1.7:1.0，含水量45%）和紗布滅菌，滅菌后把用紗布包好培養(yǎng)基放在淺盤中發(fā)酵，按固體接種方式接種，接種量為2%。淺盤尺寸為42 cm×29.5 cm，內(nèi)裝基質(zhì)500 g，厚度約為3 cm，室內(nèi)恒溫28 ℃培養(yǎng)，每天翻動使其通風(fēng)和放熱，并用加濕器保持濕度。發(fā)酵 12 d后將其風(fēng)干、粉碎、過篩，獲得棘孢木霉菌DQ-1孢子粉，測定每克孢子數(shù)。

1.2.7 棘孢木霉DQ-1孢子粉對黃瓜、辣椒、番茄、西瓜幼苗生長的影響 試驗于2019年9—12月在海南省中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州市農(nóng)場5隊溫室大棚中進行。在直徑為12 cm的塑料盆中裝入700 g基質(zhì)，將長勢均勻的健康幼苗（辣椒選用 5～6葉期幼苗，黃瓜、番茄、西瓜選用兩葉一芯期）移栽到盆中。試驗組處理如下：將經(jīng)過淺盤固體發(fā)酵并干燥后的棘孢木霉DQ-1孢子粉（1.5×1010CFU/g）稀釋1500倍，制成濃度為1×107CFU/g的孢子懸浮液，幼苗移栽后澆足底水，于第2、7 d各灌100 mL孢子懸浮液，同時在第7 d用稀釋液進行一次葉面噴霧處理。試驗第15 d時測量植株的株高、根長、地上部分鮮重及根的干重和鮮重。以清水處理作對照，每處理50株，3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2003和SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用Duncan法進行方差分析和多重比較（P＝0.05），利用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同固體發(fā)酵基質(zhì)對產(chǎn)孢量的影響

5種固體發(fā)酵基質(zhì)在發(fā)酵5 d時產(chǎn)孢量有明顯差異。產(chǎn)孢量最高的基質(zhì)是麥麩，分生孢子含量達到了1.51×109CFU/g，顯著高于其他發(fā)酵基質(zhì)，其次是稻殼，產(chǎn)孢量為1.24×109CFU/g，玉米碎粉的產(chǎn)孢量為6.96×108CFU/g，甘蔗渣和水稻秸稈的產(chǎn)孢量最低，分別為1.36×108和9.3×107CFU/g（圖1）。麥麩與稻殼均有較好的營養(yǎng)物質(zhì)，且通氣性較好，所以產(chǎn)孢量最高。玉米粉的營養(yǎng)最為豐富，但是加水后會揉成團，影響內(nèi)部空氣流通，產(chǎn)孢量較低；甘蔗渣和水稻秸稈營養(yǎng)不夠充分，產(chǎn)孢較少。因此選擇麥麩、稻殼及玉米粉并按照一定的配比作為復(fù)合發(fā)酵基質(zhì)。

圖1 不同固體發(fā)酵基質(zhì)下棘孢木霉DQ-1產(chǎn)孢量Fig.1 Spores quantity of T.asperellum DQ-1 on different solid fermentation substrate

2.2 固體發(fā)酵基質(zhì)正交試驗

3種固體基質(zhì)麥麩、玉米碎粉、稻殼與硅藻土按不同的比例復(fù)配后發(fā)酵，通過正交試驗發(fā)現(xiàn)麥麩:玉米碎粉:稻殼:硅藻土＝5.8:0.5:1.7:1.0（E組）比例的固體復(fù)配基質(zhì)發(fā)酵時，其產(chǎn)孢量最高，可達 2.63×109CFU/g；其次是麥麩:玉米碎粉:稻殼:硅藻土＝5.8:1.0:0.7:1.5（D組)，產(chǎn)孢量為2.61×109CFU/g（圖2）。

圖2 不同廢棄物發(fā)酵基質(zhì)在不同配比情況下棘孢木霉DQ-1產(chǎn)孢量Fig.2 Spores quantity of T.asperellum DQ-1 in different fermentation media

2.3 不同接種方式、接種量及發(fā)酵時間對棘孢木霉DQ-1產(chǎn)孢量的影響

不同接種方式、接種量、發(fā)酵時間的固體發(fā)酵試驗結(jié)果表明，液體接種量為2%時，產(chǎn)孢效果最好。在培養(yǎng)20 d的時間里，隨著時間的增加，棘孢木霉DQ-1產(chǎn)孢量呈先增加后降低、最后穩(wěn)定的變化趨勢；在第12 d產(chǎn)孢量達到最高，為7.18×109CFU/g，第14 d開始其孢子含量趨于穩(wěn)定。在固體接種中，4%的接種量且在第8 d產(chǎn)孢量達到頂峰，為5.30×109CFU/g，所需時間更短，但最大產(chǎn)孢量卻明顯降低，僅占液體接種方式的73.8%（圖3）。

圖3 不同接種方式、接種量及培養(yǎng)時間情況下棘孢木霉DQ-1產(chǎn)孢量Fig.3 Spore quantity of T.asperellum DQ-1 under different inoculation methods, inoculation amount and culture time

2.4 水稻秸稈替代稻殼復(fù)配發(fā)酵對產(chǎn)孢量的影響

經(jīng)過不同處理之后的水稻秸稈作為復(fù)配發(fā)酵基質(zhì)的結(jié)果顯示，當(dāng)用1、2和3 cm長度的秸稈代替稻殼進行固體發(fā)酵時，其分生孢子量分別為6.07×109、5.83×109和5.33×109CFU/g，產(chǎn)孢量均顯著低于對照組。由此可以看出，產(chǎn)孢量隨著秸稈變短而逐漸增加，當(dāng)把秸稈粉碎后作為發(fā)酵基質(zhì)時，孢子含量為8.60×109CFU/g，產(chǎn)孢量顯著高于對照組（圖4）。

圖4 以經(jīng)過不同處理的秸稈作為基質(zhì)情況下棘孢木霉DQ-1產(chǎn)孢量Fig.4 Spore quantity of T.asperellum DQ-1 with different treated straw as substrate

2.5 淺盤發(fā)酵擴大培養(yǎng)及分生孢子粉的制備

在優(yōu)化基質(zhì)配比、接種方式、接種量、培養(yǎng)時間的基礎(chǔ)上進行淺盤固體發(fā)酵，將基質(zhì)裝入淺盤中開始發(fā)酵（圖5A、B），待其生長2 d后菌絲形成（圖5C），在培養(yǎng)過程中保濕并翻動散熱，12 d后發(fā)酵完成，將其產(chǎn)物自然晾干（圖5D）粉碎過篩（圖5E），棘孢木霉DQ-1分生孢子粉達1.50×1010CFU/g。

圖5 棘孢木霉DQ-1淺盤固體發(fā)酵過程Fig.5 Solid fermentation process of T.asperellum DQ-1 in shallow plate

2.6 棘孢木霉DQ-1分生孢子粉對黃瓜、辣椒、番茄和西瓜幼苗生長的影響

棘孢木霉DQ-1發(fā)酵孢子粉配制的懸浮液對4種作物幼苗的處理中，在番茄幼苗上施用DQ-1分生孢子粉效果尤為突出，其株高、根長、地上鮮重、根鮮重和干重都與對照之間存在顯著差異，增長率分別為14.66%、27.26%、42.23%、242.86%和51.77%；其次在黃瓜上施用DQ-1分生孢子粉效果也較好，除了根長方面不存在顯著差異外，其余株高、地上部分鮮重、根鮮重和干重4項指標(biāo)相比于對照均有顯著的增長，增長率分別為30.13%、27.53%、88.70%和33.96%；對于辣椒幼苗，施用DQ-1分生孢子粉對辣椒根長增長顯著，增長率為 14.86%，其余各項生理指標(biāo)有一定的提高，但增長效果不明顯；西瓜幼苗施用 DQ-1分生孢子粉后，其根長比對照減少了11.22%，是本試驗中施用DQ-1分生孢子粉后唯一帶來負面影響的生理指標(biāo)，但其地上部分鮮重和根干重兩項指標(biāo)與對照相比有明顯增長，增長率分別為97.47%和41.86%。綜合評估，棘孢木霉DQ-1對4種作物幼苗存在明顯的促進生長效果，在番茄上的表現(xiàn)效果尤為突出，且對于番茄的根部鮮重存在接近于3.5倍的增重效果。在洗根時發(fā)現(xiàn)，大部分施用棘孢木霉DQ-1的作物根系更加發(fā)達，數(shù)量更多，此外，作物的莖有明顯的增粗，葉片呈現(xiàn)更加健康的深綠色。因此，棘孢木霉DQ-1分生孢子粉作為生物制劑應(yīng)用在4種作物幼苗上，能夠促進作物生長（表2，圖6）。

圖6 棘孢木霉DQ-1對4種作物幼苗的促生效果Fig.6 Growth promoting effect of T.asperellum DQ-1 on four crop seedlings

表2 棘孢木霉DQ-1對4種作物形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響Table 2 Effects of T.asperellum DQ-1 on morphological indexes of four crops

3 討論

在對單一因素發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)麥麩產(chǎn)量最高，研究發(fā)現(xiàn)麥麩富含纖維素、半纖維素以及蛋白質(zhì)、脂肪、低聚糖等成分，且發(fā)酵后粗蛋白、粗纖維等含量均有顯著提高，能為木霉提供較多的營養(yǎng)供應(yīng)[13,14]。但麥麩成本較高，且在含水量較高時通氣性較差。因此國內(nèi)大部分木霉的固體發(fā)酵基質(zhì)多為麩皮、秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物與營養(yǎng)元素混合。如宋曉妍等[15]用麩皮和玉米秸粉混合對木霉進行發(fā)酵，靖德兵等[16]利用稻草粉、麩皮、硫酸銨混合進行康氏木霉發(fā)酵，羅洋等[17]用桔皮和麥麩混合進行里氏木霉發(fā)酵。

固態(tài)發(fā)酵一般由兩部分原料構(gòu)成，一種是如麩皮、豆粕、無機鹽等供給養(yǎng)分的營養(yǎng)料，另一種是如稻殼、玉米皮、花生皮等促進通風(fēng)的填充料[18]。本研究將麥麩、玉米碎粉、稻殼與硅藻土混合，保證了其營養(yǎng)和通氣，并通過正交試驗得到產(chǎn)孢量最優(yōu)的發(fā)酵配比5.8:0.5:1.7:1.0，第5 d產(chǎn)孢量為2.63×109CFU/g。

接種量和接種方式對木霉產(chǎn)孢量影響巨大，接種量過小不利于混勻，且會延長發(fā)酵周期，增加成本[19]。液體接種量過大時會引起溶氧不足，移入代謝廢物，影響產(chǎn)孢[20]。本研究將接種方式、接種量、培養(yǎng)時間3個條件綜合分析，獲得最優(yōu)發(fā)酵條件為液體接種2%，培養(yǎng)時間為12 d，最大產(chǎn)孢量為5.87×109CFU/g。茹水江[21]在固體碎米基質(zhì)上發(fā)酵的哈茨木霉最佳接種量為4%，第8 d時產(chǎn)孢量達到最大，之后略有下降并趨于穩(wěn)定。周蓮等[22]研究的淡紫擬青霉在固體接種量為0.5%，培養(yǎng)7 d時產(chǎn)孢量最大。本研究的棘孢木霉DQ-1在液體接種過程中增大接種量至3%、4%后，其最大產(chǎn)量沒有升高，與董海燕[23]所研究的棘孢木霉最佳接種量12.4%有較大差別，分析原因是其先單獨研究接種量對產(chǎn)孢的影響，優(yōu)化后再確定發(fā)酵時間，與本文的將接種方式、接種量、培養(yǎng)時間三者結(jié)合研究，以求最高產(chǎn)孢量的方法存在一定差別，此外，不同菌株、不同培養(yǎng)基質(zhì)所匹配的最佳接種量、發(fā)酵時間也有不同。

我國的大部分水稻秸稈都通過焚燒、堆垛形式處理，浪費資源的同時又污染環(huán)境，因此本文將其作為微生物發(fā)酵基質(zhì)進一步發(fā)掘其農(nóng)業(yè)應(yīng)用價值，在單一發(fā)酵基質(zhì)試驗中，沒有將水稻秸稈粉碎，導(dǎo)致其產(chǎn)孢量較低。黃達名等[24]提到，在固態(tài)發(fā)酵中，原料粉碎得細, 可提高利用率和產(chǎn)量。因此本研究進一步探索了不同處理方式的秸稈替代稻殼作為復(fù)配發(fā)酵基質(zhì)時對棘孢木霉DQ-1的產(chǎn)孢量影響。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，水稻秸稈可以代替稻殼作為木霉菌的固體發(fā)酵基質(zhì)，粉碎后的秸稈產(chǎn)孢量顯著高于未粉碎的秸稈，并優(yōu)于稻殼。任佐華[25]對水稻秸稈多菌接種混合發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)粗蛋白含量為 15.22%，超過了麥麩處理。將秸稈粉碎后，有利于棘孢木霉更充分的利用營養(yǎng)物質(zhì)。另一方面，水稻秸稈中纖維素分子的連接鍵在 25 ℃下的半衰期為 500～800萬年，在自然狀態(tài)下極難分解[26]。利用木霉菌等微生物可有效降解秸稈中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素[27]。棘孢木霉DQ-1可較好的利用秸稈進行發(fā)酵，存在一定的生物降解能力，可進一步開發(fā)其在微生物降解方面的應(yīng)用價值。

采用本研究的最優(yōu)發(fā)酵基質(zhì)配比和最優(yōu)發(fā)酵條件，通過淺盤固體發(fā)酵并干燥粉碎后得到的棘孢木霉DQ-1純孢子粉含量可達 1.50×1010CFU/g，最終的木霉孢子含量得到了大幅度提升。易征璇等[28]研究提到，木霉分生孢子采用淺盤法進行發(fā)酵有利于工廠化的擴大培養(yǎng)，且在淺盤發(fā)酵時要及時對培養(yǎng)基進行翻動，進行通氧和放熱，發(fā)酵好的培養(yǎng)物盡快進行風(fēng)干粉碎，便于保存。此外，若在實際生產(chǎn)過程中，無法測定孢含量時，也可通過發(fā)酵產(chǎn)物的外觀判斷是否終止發(fā)酵過程[29]。

采用本試驗獲得的木霉孢子粉通過葉面噴施和灌根應(yīng)用于黃瓜、西瓜、番茄、辣椒4種作物幼苗，西瓜根長相比對照有所減少，但根系變粗，根重增加。對于西瓜作物，國內(nèi)研究大多是木霉對西瓜枯萎病的防治，對于西瓜促生方面研究較少。周池卉等[30]驗證了在一定程度上，哈茨木霉菌劑在西瓜上施用越多，西瓜秧苗長勢越好。針對作物番茄，陸寧海等[31]和曲薇等[32]研究的哈茨木霉，孫冬梅等[33]的黃綠木霉均對番茄幼苗有良好的促生作用，其一般機理是木霉可提高作物對營養(yǎng)元素的吸收，提高光合作用，促進根系生長發(fā)育，本研究的棘孢木霉DQ-1同樣對番茄幼苗促生長效果較明顯。張春秋等[34]研究發(fā)現(xiàn)棘孢木霉、哈茨木霉、擬康氏木霉均可提高黃瓜葉綠素含量、株高、莖粗等指標(biāo)，與本研究結(jié)果一致。趙興麗等[35]研究的鉤狀木霉使辣椒的株高、根長、鮮重和干重分別增長13.5%、16.2%、43.8%和45.3%。胡瓊[36]研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉與土以1:10混合，對辣椒的促生效果最為明顯。本試驗獲得的棘孢木霉DQ-1對辣椒幼苗也有一定的促進生長效果。