呂焱

目前結(jié)直腸癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率、死亡率分別位居惡性腫瘤的第三位、第二位[1]。近20 多年來(lái)，結(jié)直腸癌在腫瘤篩查和免疫治療方面取得了很大進(jìn)步，患者的生存狀況也得到了改善。早期診斷、早期治療可以使結(jié)直腸癌患者的10 年生存率提高至93%。但是，對(duì)于那些已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期患者，治療效果欠佳，10 年生存率仍然低于8%[2-5]。目前，結(jié)直腸癌治療仍以手術(shù)為主，盡管輔助化療可提高根治性切除術(shù)后患者的生存率[6]，但患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的概率仍然徘徊在30%～60%[7]。因此，目前需要一個(gè)合適的生物標(biāo)志物來(lái)協(xié)助診斷結(jié)直腸癌及其評(píng)估預(yù)后。有研究認(rèn)為，人體在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)從原發(fā)灶脫離出來(lái)，而后隨血液循環(huán)進(jìn)入其他部位，其中大部分會(huì)被人的免疫系統(tǒng)識(shí)別并吞噬，或者自行發(fā)生凋亡，但那些少數(shù)殘存的會(huì)處于休眠狀態(tài)，并在血液循環(huán)中散播，成為循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）。當(dāng)微環(huán)境合適時(shí)，CTCs 就會(huì)定植在這些人體組織中，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。CTCs 可以存在于腫瘤發(fā)生的各個(gè)時(shí)期，早期較少，中晚期出現(xiàn)率會(huì)增加。CTCs 可以從患者外周靜脈血中檢測(cè)出來(lái)，這和傳統(tǒng)的活檢相比，這種檢測(cè)方法創(chuàng)傷小，可多時(shí)間點(diǎn)采樣，有利于觀察患者的病情進(jìn)展及治療反應(yīng)，因此又被稱為“液體活檢”[8]。本研究選擇了我院2017 年3 月1 日—2019 年6 月30 日所治療的結(jié)直腸癌患者40 例、良性腫瘤對(duì)照36 例，檢測(cè)外周血中CTCs 數(shù)量計(jì)算陽(yáng)性率并分析其與血清CEA、腫瘤組織病理特征、脈管癌栓、術(shù)后復(fù)發(fā)之間的關(guān)系，探討CTCs 在結(jié)直腸癌預(yù)后中的意義。

1 基本資料和方法

1.1 一般資料

本研究收集2017 年3 月1 日—2019 年6 月30 日在我院胃腸外科收治的結(jié)直腸癌患者40 例作為研究對(duì)象，其中男性26 例，女性14 例，年齡28 ～83 歲；結(jié)直腸段良性病變者36 例作為陰性對(duì)照，其中女性15 例，男性21 例，年齡46 ～86 歲。所有患者術(shù)后病理組織學(xué)檢查均依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（union international cancer control，UICC）第7 版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行術(shù)后TNM 分期（tumor node metastasis，TNM）。本設(shè)計(jì)已經(jīng)通過(guò)了我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且入選的患者及其家屬簽訂了知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象納入排除標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)直腸癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者在手術(shù)前均經(jīng)過(guò)內(nèi)鏡檢查，病理結(jié)果和免疫組化結(jié)果可以確診為結(jié)直腸癌；（2）患者在術(shù)前沒(méi)有接受過(guò)化療、各種抗腫瘤治療及免疫治療；（3）術(shù)前充分知情告知，并能遵從醫(yī)囑可以定期返院復(fù)查；（4）無(wú)絕對(duì)的手術(shù)禁忌癥，可耐受標(biāo)準(zhǔn)結(jié)直腸癌根治性切除術(shù)；（5）患者術(shù)后均按期進(jìn)行方案化療。

結(jié)直腸癌組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前沒(méi)有被明確診斷為結(jié)直腸癌；（2）術(shù)前接受過(guò)抗腫瘤治療；（3）患者術(shù)后的病理結(jié)果提示切緣陽(yáng)性（包括上、下切緣及環(huán)周切緣）；（4）患有或曾經(jīng)患有其他腫瘤性疾??；（5）依從性差，不能按期隨訪；（6）無(wú)自主行為能力，不符合相關(guān)倫理要求。

對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）同期經(jīng)病理結(jié)果可確診為良性病變者（包括慢性炎癥、良性潰瘍等）；（2）年齡、性別與入選的結(jié)直腸癌組患者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；（3）既往沒(méi)有任何腫瘤病史。

對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）無(wú)法確診為良性病變者；（2）有腫瘤病史者。

1.2.2 CTCs 的檢測(cè) 采用陰性富集聯(lián)合免疫熒光原位雜交法，所有標(biāo)本檢測(cè)均在24 h 內(nèi)完成。首先用ACD 抗凝管采集外周血6 mL，離心去除血漿后用低滲溶液裂解紅細(xì)胞，并用抗CD45 免疫磁珠去除白細(xì)胞。獲得的細(xì)胞用100 μl 2%多聚甲醛涂片固定在載玻片上，于干燥箱中33℃干燥，待標(biāo)本徹底干燥后進(jìn)行CTCs 染色鑒定。將標(biāo)本進(jìn)行酒精梯度脫水加入20 μl CD45-AF594 熒光抗體，用10 μl DAPI 復(fù)染封片后，在熒光顯微鏡下觀察全片或于2 ～8℃避光保存，為避免FISH 信號(hào)及抗體染色熒光減弱對(duì)結(jié)果造成影響，標(biāo)本務(wù)必在一周內(nèi)完成檢測(cè)。在熒光顯微鏡上反復(fù)觀察標(biāo)本會(huì)使熒光淬滅，所以在第一次讀片時(shí)儲(chǔ)存細(xì)胞圖片。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）的識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)：CD45-：紅色信號(hào)為陰性，或者呈現(xiàn)淡淡的標(biāo)記，與白細(xì)胞最明顯的區(qū)別是沒(méi)圍繞細(xì)胞核的鮮明紅色光環(huán)；DAPI+：標(biāo)記細(xì)胞核，顯藍(lán)色，圓或橢圓形；CEP8+異倍體（非二倍體）：信號(hào)在橙色通道下均很清晰。本研究中CTCs 在結(jié)直腸段良性病變者中檢出數(shù)為0 ～5 個(gè)/6 mL，其檢出中位數(shù)為0 個(gè)/6 mL；結(jié)直腸癌患者中檢出數(shù)為0 ～16 個(gè)/6 mL，其檢出中位數(shù)為5 個(gè)/6 mL。受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線）提示：選取最佳臨界值為3個(gè)細(xì)胞/6 mL 血時(shí)（AUC ＝0.802，95%CI；0.633 ～0.971；P＜0.001），此時(shí)CTCs 檢測(cè)在結(jié)直腸癌中的靈敏度為71.4%，特異性為83.3%（圖1）。因此本研究中，CTCs 檢出數(shù)≥3 個(gè)/6 mL 判斷為CTCs 陽(yáng)性，＜3 個(gè)/6 mL 判斷為CTCs 陰性。

1.2.3 血清CEA 的檢測(cè) 使用Beckman Access 免疫分析系統(tǒng)和原裝試劑盒進(jìn)行雙位點(diǎn)夾心法酶免疫分析測(cè)定血清CEA。將待測(cè)血清加入反應(yīng)管，同時(shí)加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗CEA 第一位點(diǎn)的大鼠單抗和與磁性顆粒結(jié)合的抗-CEA，反應(yīng)管被傳送到磁性分離區(qū)域進(jìn)行多次沖洗，去除未和固相結(jié)合的其他成分后，加入化學(xué)發(fā)光底物，反應(yīng)體系中光量子被光電比色計(jì)所檢測(cè)，光量子與血清CEA 濃度成正比。根據(jù)光量子與標(biāo)準(zhǔn)品CEA 的對(duì)應(yīng)關(guān)系，計(jì)算出血清中CEA 濃度；0 ～5 ng/mL 判定為CEA 陰性，＞5 ng/mL 為CEA 陽(yáng)性。

1.2.4 脈管癌栓的檢測(cè) 標(biāo)本做成石蠟切片后經(jīng)蘇木精-伊紅染色法（HE）染色或特殊彈力纖維染色，顯微鏡下若見(jiàn)到血管或淋巴管內(nèi)有癌細(xì)胞巢團(tuán)視為陽(yáng)性；鏡下不能直接判斷為陽(yáng)性者，須經(jīng)免疫組化標(biāo)記CD31、CD34、D2-40，陽(yáng)性者亦視為脈管癌栓陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo)

定期對(duì)40 例結(jié)直腸癌患者和36 例良性病變者進(jìn)行嚴(yán)格的隨訪。術(shù)后無(wú)瘤生存期為行手術(shù)至疾病復(fù)發(fā)或末次隨訪時(shí)間（2020年10 月31 日）。時(shí)間以月份為單位統(tǒng)計(jì)，詳細(xì)記錄患者術(shù)后組織病理學(xué)資料、隨訪資料。術(shù)后1 個(gè)月第一次在門診的復(fù)診內(nèi)容包括血常規(guī)、血清CEA、腹部彩超、腹部CT、盆腔MRI 和胸部X 線等。術(shù)后6 個(gè)月進(jìn)行第二次復(fù)查。以后每6 個(gè)月返院復(fù)查一次。以活檢病理結(jié)果和（或）影像學(xué)診斷作為結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析均用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件完成，各組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，用ROC 曲線分析CTCs診斷的特異性和敏感性。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者中陽(yáng)性率高于良性病變組

在入組的40 例結(jié)直腸癌患者中，術(shù)前CTCs 陽(yáng)性率是62.5%，在良性腫瘤組中，陽(yáng)性率是5.6%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 結(jié)直腸癌及良性結(jié)直腸腫瘤患者CTCs 與病理特征的關(guān)系

結(jié)直腸癌組CTCs 陽(yáng)性率高于良性腫瘤對(duì)照組，結(jié)腸癌患者CTCs 陽(yáng)性率在不同性別、年齡組（小于與大于等于61 周歲）間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)直腸癌患者CTCs 陽(yáng)性率與腫瘤發(fā)生部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；結(jié)腸癌高于直腸癌，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者CTCs 陽(yáng)性率增高。但是，CTCs 陽(yáng)性率與腫瘤的分化程度、T 分期（浸潤(rùn)深度、腫瘤大小）等無(wú)相關(guān)（表2）。

2.3 結(jié)直腸癌及良性結(jié)直腸腫瘤患者CTCs 與血清CEA 的關(guān)系

結(jié)直腸癌患者組與對(duì)照組中的CEA 陽(yáng)性率分別為32.5%和5.6%，P=0.004，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以CEA 陽(yáng)性、陰性將結(jié)直腸癌患者組分為兩組，CTCs 陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。將CTCs 檢出水平與CEA 檢出水平做對(duì)比，分別檢測(cè)出對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的患者術(shù)前CTCs 及CEA 結(jié)果，并作出各自的ROC 曲線，CEA 的AUC=0.628（95%CI0.436 ～0.820，P＜0.001）， 低 于CTCs 的AUC（0.802），顯示CTCs 在對(duì)結(jié)直腸癌診斷預(yù)測(cè)價(jià)值優(yōu)于CEA。CEA 對(duì)結(jié)直腸癌診斷的特異性較高，但敏感性較差，不是結(jié)直腸早期診斷的最佳選擇。CTCs 具有較高的敏感性和特異性，可作為結(jié)直腸癌早期診斷的標(biāo)志物（圖2）。

2.4 術(shù)前CTCs 計(jì)數(shù)與結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間的關(guān)系

對(duì)40 例患者進(jìn)行術(shù)后監(jiān)測(cè)，平均每2 ～3 個(gè)月進(jìn)行一次病史、體格檢查以及實(shí)驗(yàn)室檢查，每半年進(jìn)行一次CT 掃描，每年進(jìn)行一次胸片和結(jié)腸鏡檢查。同時(shí)對(duì)患者自采血之日起進(jìn)行門診、電話等方式隨訪，隨訪終點(diǎn)是疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，以判定無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間（PFS）。PFS 定義為采血檢測(cè)CTCs 至化療期間或化療后病情進(jìn)展的時(shí)間。隨訪截止日期為2020 年10 月31 日，40 例入組患者無(wú)失訪者。

隨訪期截止時(shí)，肝轉(zhuǎn)移患者有22 例，無(wú)肝轉(zhuǎn)移患者18 例。肝轉(zhuǎn)移患者CTCs 陽(yáng)性率高于無(wú)肝轉(zhuǎn)移患者（81.8%vs.38.9%，P＜0.05）。根據(jù)隨訪資料，將本研究中的患者樣本分為CTCs 計(jì)數(shù)陰性組（CTCs ＜3 個(gè)/5 mL）和CTCs 陽(yáng)性組（CTCs ≥3 個(gè)/5 mL），進(jìn)行Kaplan-Meier 生存率分析，結(jié)果顯示CTCs 陽(yáng)性患者的PFS 低于CTCs 陰性的患者，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

2.5 結(jié)直腸癌患者術(shù)前CTCs 與脈管癌栓的關(guān)系

對(duì)40 例患者的病理報(bào)告進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，如表5 所見(jiàn)，術(shù)前CTCs 陽(yáng)性的結(jié)直腸癌患者術(shù)后脈管癌栓陽(yáng)性者高于術(shù)前CTCs 陰性者，同樣，術(shù)前CTCs 陰性的患者術(shù)后脈管癌栓陰性率高于CTCs 陽(yáng)性者。兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 結(jié)直腸癌與良性腫瘤患者CTCs 陽(yáng)性率[例（%）]

表2 CTC 陽(yáng)性率與臨床病理特征的相關(guān)性

表3 CEA 陽(yáng)性及陰性結(jié)直腸癌患者CTCs 陽(yáng)性率[例（%）]

表4 術(shù)前CTCs 陽(yáng)性及陰性結(jié)直腸癌患者的肝轉(zhuǎn)移數(shù)量[例（%）]

表5 術(shù)前CTCs 陽(yáng)性及陰性結(jié)直腸癌患者脈管癌栓情況[例（%）]

圖1 結(jié)直腸癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞ROC 曲線

圖2 受試者術(shù)前ROC 曲線

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，有專家指出對(duì)早中期結(jié)直腸癌患者的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療可以降低腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率，也能夠避免很多不必要的治療手段，避免給患者帶來(lái)較大的副作用，因此目前精準(zhǔn)管理結(jié)直腸癌的治療尤為重要。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）的概念是Ashworth 在1869 年首次提出的[9]，是從患者腫瘤病理組織轉(zhuǎn)移到血液中的細(xì)胞，可以表現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞的遺傳和表觀特征。目前，隨著CTCs 檢測(cè)技術(shù)的不斷更新，靈敏度、特異性較以往均有大幅度的提升，已經(jīng)能夠成為腫瘤的非創(chuàng)性診斷工具，協(xié)助臨床對(duì)腫瘤進(jìn)行診斷和預(yù)后。

有研究表明，對(duì)于消化系統(tǒng)惡性腫瘤的患者，血清中的CTCs可以通過(guò)細(xì)胞黏附分子附著于血管內(nèi)皮上，這個(gè)新發(fā)現(xiàn)為癌癥轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[10]，而且這一研究已通過(guò)小鼠模型的臨床前研究得到了證實(shí)[11]。本研究采用的是免疫熒光原位雜交技術(shù)（iFISH），是將免疫熒光染色方法與原位雜交方法相整合，使用CK、CD45、DAPI 分析細(xì)胞表面蛋白表型并結(jié)合CEP-8 檢測(cè)染色體核型來(lái)共同識(shí)別CTCs。與其他單純的免疫熒光染色方法或者單純?nèi)旧w的原位雜交方法相比，檢出率更高，可以更好的反映患者體內(nèi)CTCs 水平。

本研究顯示，結(jié)直腸癌患者術(shù)前CTCs 陽(yáng)性率為62.5%，而術(shù)前CEA 陽(yáng)性率為32.5%，所以，在結(jié)直腸癌的早期診斷上，CTCs比CEA 具有更高的敏感性和特異性。由于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者CTCs 陽(yáng)性率增高，而且結(jié)腸癌高于直腸癌，提示結(jié)腸癌患者更易發(fā)生轉(zhuǎn)移。有研究認(rèn)為，CTCs 檢出率是結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，CTCs 陽(yáng)性患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞與患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性[12]。這與我們的研究結(jié)果，肝轉(zhuǎn)移患者的CTCs 陽(yáng)性率高于未見(jiàn)肝轉(zhuǎn)移患者基本一致。

另外，研究中還發(fā)現(xiàn)，術(shù)前CTCs 陽(yáng)性的結(jié)直腸癌患者，術(shù)后病理組織中更易發(fā)現(xiàn)脈管癌栓，脈管癌栓是癌細(xì)胞局部浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)可能會(huì)留下的痕跡，是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的一個(gè)重要步驟，因此它是評(píng)估患者生存期的一個(gè)可靠指標(biāo)。術(shù)前CTCs 陽(yáng)性可提示結(jié)直腸癌患者存在脈管癌栓可能性較高，可提高對(duì)術(shù)前判斷有無(wú)脈管侵犯的準(zhǔn)確性，對(duì)結(jié)直腸癌的術(shù)前輔助治療提供依據(jù)。

綜上所述，CTCs 具有預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的評(píng)估效能，有望成為結(jié)直腸癌篩查與診斷的有效指標(biāo)，為臨床上更早地發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移提供了重要的評(píng)價(jià)依據(jù)。