胡其艷

（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130021）

肺癌的發(fā)病率及死亡率均居于其他腫瘤的首位。據(jù)統(tǒng)計，全球每年死于癌癥的患者中，肺癌患者的占比約為20 ～25%。非小細胞肺癌是肺癌的分型之一。有研究資料顯示，約有48% 的非小細胞肺癌患者存在p53 基因點突變的情況[1]。另有研究資料顯示，p53 基因點突變的發(fā)生是導(dǎo)致肺癌的主要原因[2]。在本次研究中，筆者主要分析p53基因點突變的發(fā)生與非小細胞肺癌患者病理生理特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究對象是2018 年4 月至2019 年4 月期間吉林大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的53 例非小細胞肺癌患者。在這53例患者中，有男35 例，女18 例；其平均年齡為（58.2±3.3）歲；其平均腫瘤直徑為（4.6±2.8）cm；其中有33 例腺癌患者，20 例鱗癌患者；其中病理分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者有21 例，為Ⅲ～Ⅳ期的患者有32 例；其中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者有29 例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者有24 例。

1.2 方法

采用聚合酶鏈反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法對這53 例患者進行p53 基因點突變檢測，方法為：用石蠟包埋患者的病理組織，并做成石蠟標(biāo)本。將石蠟標(biāo)本切成2 張6 ～8 μm厚的薄片，將切好的薄片置入試管中。對薄片進行常規(guī)脫蠟處理。將處理后所得的液體進行離心處理。將離心后獲取的上清液作為標(biāo)本，并放在室溫下干燥10 ～20 min，加入適量的消化液及蛋白酶K，然后加入等體積的氯仿與異戊醇的混合溶液對標(biāo)本進行提取，再加入適量的醋酸鈉。在零下20℃對標(biāo)本進行過濾及15 min 的離心，取上清液。向上清液中加入適量的TE 緩沖液，以溶解其中的DNA，并放入4℃冰箱中保存。取含有200 ngDNA 的上清液（用紫外分光光度計測定DNA 的含量）作為反應(yīng)模板。設(shè)計擴增p53 基因外顯子引物的方案（擴增第5 外顯子上游引物的順序 為5’-TTCCTCTTCCTGCAGTACTCC-3’，擴 增 第5 外顯子下游引物的順序為5’-GCCCCAGCTGCTCACCATCG-3’；擴 增 第6 外 顯 子 上 游 引 物 的 順 序 為5’-CACTGATTGCTCTTAGGTCG-3’，擴增第6 外顯子下游引 物 的 順 序 為5’-AGTTGCAAACCAGACCTCAGG-3’；擴 增 第7 外 顯 子 上 游 引 物 的 順 序 為5’-TCTCCTAGGTTGGCTCTGAC-3’，擴增第7 外顯子下游引物的順序為5’-GAAGTGGCTCCTGACCTGGA-3’；擴 增 第8 外 顯 子 上 游 引 物 的 順 序 為5’-CCTAATCCTGAGTAGTGGTAA-3’，擴增第8 外顯子下游引物的順序為5’-GTCCTGCTTGCTTACCTCG-3’）。將反應(yīng)模板加入滅菌的液體石蠟油中，以預(yù)防反應(yīng)模板出現(xiàn)蒸發(fā)現(xiàn)象。對反應(yīng)模板進行10 min 的預(yù)變性，加入冰塊及Taq 酶后置在冰上。對反應(yīng)模板進行30″的離心處理，取沉淀物按照設(shè)計的方案進行p53 基因外顯子擴增，擴增后放置在冰上。然后，對沉淀物進行非變性聚丙烯酰胺電泳，加入銀染用溶液，根據(jù)顯示出DNA 帶紋可確定是否存在p53 基因點突變的情況。每一例標(biāo)本均取相應(yīng)位置的正常肺部組織作為對照。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察這53 例患者發(fā)生p53 基因點突變的情況及發(fā)生p53 基因點突變與其病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

對本次研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，采用t 檢驗，計數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2 檢驗。以P ＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 這53 例患者發(fā)生p53 基因點突變的情況

在這53 例患者中，有27 例患者發(fā)生p53 基因點突變（其中有15 例患者發(fā)生p53 基因第5 外顯子突變，有2 例患者發(fā)生p53 基因第6 外顯子突變，有10 例患者發(fā)生p53基因第8 外顯子突變），發(fā)生p53 基因點突變患者的占比為50.9%；有26 例未發(fā)生p53 基因點突變，未發(fā)生p53 基因點突變患者的占比為49.1%。

2.2 這53 例患者發(fā)生p53 基因點突變與其臨床病理生理特征的相關(guān)性

在這53 例患者中，病理分期為Ⅰ～Ⅱ期的非小細胞肺癌患者p53 基因點突變的發(fā)生率低于病理分期為Ⅲ～Ⅳ期的非小細胞肺癌患者，P ＜0.05 ；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者p53 基因點突變的發(fā)生率高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者，P ＜0.05。詳見表1 和表2。

表1 這53 例患者中不同病理分期的患者發(fā)生p53 基因點突變的情況[n（%）]

表2 這53 例患者中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未轉(zhuǎn)移患者發(fā)生p53 基因點突變的情況[n（%）]

3 討論

癌基因的變化及抑癌基因的變化在癌細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的過程中起著重要的作用。有研究資料顯示，小細胞肺癌患者及非小細胞肺癌患者均存在p53 基因點突變的情況。在本次研究中，采用聚合酶鏈反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法對非小細胞肺癌患者進行p53 基因點突變檢測時，標(biāo)本p53基因的第6 外顯子擴增產(chǎn)物在201bP 區(qū)域出現(xiàn)DNA 條帶，第7 外顯子擴增產(chǎn)物在171bP 區(qū)域出現(xiàn)DNA 條帶，獲得的這兩條DNA 條帶的高度與設(shè)計的條帶高度一致。這說明擴增p53 基因外顯子成功。對非小細胞肺癌患者進行p53 基因點突變檢測時使用不同的變性液（如堿變性液、甲酰胺變性液及氫氧化甲基汞變性液）對同一擴增產(chǎn)物進行電泳的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1）堿變性液處理獲得的帶紋較弱。2）甲酰胺變性液及氫氧化甲基汞變性液處理獲得的帶紋較為接近設(shè)計的帶紋。3）使用8% 氫氧化甲基汞變性液、10% 氫氧化甲基汞變性液及8%氫氧化甲基汞變性液處理獲得的條帶較清晰。p53 基因是一種能與DNA 進行特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。p53 基因具有阻滯細胞周期（G1 期～G2 期）、誘導(dǎo)細胞凋亡、加速細胞分化的作用。p53 基因的突變及失活可促進腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。野生型p53 基因?qū)毎芷谄鸬截撔哉{(diào)節(jié)作用，能夠抑制細胞的過度生長。突變型p53 基因可抑制細胞的生長，促進細胞的轉(zhuǎn)化，進而可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。有相關(guān)研究顯示，p53 基因突變的發(fā)生存在于大多數(shù)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展的過程中[3]。腫瘤組織發(fā)生p53 基因異常的主要原因有基因缺失、基因重組、基因突變等。常見的p53 基因突變?yōu)辄c突變。p53 基因發(fā)生突變時可喪失抑制腫瘤生長的功能。進行p53 基因突變檢測的方法有免疫組化法、化學(xué)酶切法、聚合酶反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法等。有學(xué)者指出，采用免疫組化法對癌組織的DNA 進行p53 基因突變檢測的陽性率較高[4-5]。這可能是由于p53 基因的半衰期非常短，進行檢測時腫瘤組織中的p53 基因是發(fā)生突變后的基因。有研究資料顯示，采用聚合酶反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法對腫瘤組織進行p53 基因突變檢測的敏感度為81 ～92%。約有50% 的非小細胞癌患者及約有75% 的小細胞癌患者可發(fā)生p53 基因突變。p53 基因突變位點多發(fā)生在DNA 序列的保守區(qū)域中。本次研究的結(jié)果顯示，在這53 例患者中，有27 例患者發(fā)生p53 基因點突變，發(fā)生p53基因點突變患者的占比為50.9%；有26 例未發(fā)生p53 基因點突變，未發(fā)生p53 基因點突變患者的占比為49.1%。這53 例患者中病理分期為Ⅰ～Ⅱ期的非小細胞肺癌患者p53基因點突變的發(fā)生率低于這53 例患者中病理分期為Ⅲ～Ⅳ期的非小細胞肺癌患者，P ＜0.05 ；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者p53 基因點突變的發(fā)生率高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者，P ＜0.05。從本次研究的結(jié)果可以看出，隨著非小細胞肺癌患者病情的加重，其p53 基因點突變的發(fā)生率升高。

綜上所述，p53 基因點突變的發(fā)生與非小細胞肺癌患者的病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況具有相關(guān)性。