梁小弟，梁小菊，李芙蓉，石茂才

(1.定西市人民醫(yī)院骨二科，甘肅 定西 743000；2.西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院小兒骨科，陜西 西安 710054；3.定西市人民醫(yī)院麻醉科，甘肅 定西 743000)

骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨退化和關(guān)節(jié)炎癥為特征的關(guān)節(jié)退行性疾病[1-2]。骨關(guān)節(jié)炎是由年齡、性別、肥胖、遺傳等系統(tǒng)因素與局部因素相互作用的復(fù)雜結(jié)果[3-4]。軟骨細(xì)胞負(fù)責(zé)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和周轉(zhuǎn)，對(duì)關(guān)節(jié)功能至關(guān)重要[5]。Smad核相互作用蛋白1(Smad nuclear interaction protein 1，SNIP1)是一個(gè)抑炎蛋白，已有研究表明白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)處理可顯著降低腸上皮細(xì)胞中SNIP1的表達(dá)，且SNIP1有助于降低腸上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[6]。在小鼠胚胎腎293細(xì)胞中，SNIP1抑制炎癥通路NF-κB的表達(dá)[7]。過表達(dá)SNIP1還可以減弱了miR-335對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用[8]。本文主要目的是研究SNIP1對(duì) IL-1β 誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及其分子機(jī)制，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞NHAC-κn(ATTC，美國(guó))；DMEM-F12培養(yǎng)基(ThermoFisher，No.11320-033)；胎牛血清(Thermo Fisher，No.10099158)；脂質(zhì)體3000(Invitrogen公司，美國(guó))；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)；蛋白提取試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)；抗一氧化氮合酶(iNOS)抗體、抗環(huán)氧合酶-2(COX-2)抗體、抗Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ)抗體、抗基質(zhì)金屬蛋白酶-13(Matrix metalloproteinase 13，MMP-13)抗體、抗MMP-3抗體、抗聚集蛋白聚糖(Aggrecan)抗體、抗磷酸化細(xì)胞核因子-κBp65(NF-κB p-p65)抗體、抗磷酸化核因子抑制蛋白(p-IκB)抗體、抗GAPDH抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)二抗 (稀釋比為1∶5000)購自英國(guó)Abcam公司；ELISA檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 低溫高速離心機(jī)和多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher，美國(guó))，熒光定量PCR儀、分光光度計(jì)(Bio-Rad，美國(guó))，凝膠成像系統(tǒng)(ABI，美國(guó))，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理：在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)中培養(yǎng)NHAC-κn，將培養(yǎng)基置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中。按照 Lipfectamine 3000說明書，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NHAC-κn細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用IL-1β(0、5、10、20 ng/ml)處理NHAC-κn 24 h構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型。NHAC-κn細(xì)胞被分為未處理組(untreated)、空白對(duì)照組(IL-1β)、空載體組(IL-1β+pcDNA3.1)、 過表達(dá)組(IL-1β+pcDNA3.1-SNIP1)。

1.3.2 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性：將轉(zhuǎn)染成功的5×103/ml NHAC-κn細(xì)胞在96孔板上培養(yǎng)24 h后，在每個(gè)孔中加入10 μl CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm的吸光度。

1.3.3 一氧化氮(NO)含量的測(cè)定：將細(xì)胞(3×105/ml)接種于6孔板培養(yǎng)，24 h后用Griess反應(yīng)測(cè)定NO濃度。在543 nm波長(zhǎng)下測(cè)量每個(gè)樣品的吸光度。

1.3.4 RNA檢測(cè)SNIP1表達(dá)：用TRIzol試劑將總RNA從軟骨細(xì)胞中分離出來，并反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。采用10 μl PCR反應(yīng)體系，包含4.5 μl稀釋cDNA，0.25 μl正向引物，0.25 μl反向引物和5 μl SYBR Green Mix。引物序列物如下：SNIP1 F/R：5’-TGCGGTCTTTCAATATCGGC-3’，5’-AGAAGGTTCCATTGCCTGAGC-3’；GAPDH F/R：5’-GGGAAACTGCGGCGTGAT-3’，5’-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’。GAPDH為內(nèi)參基因。用 2-ΔΔCT法表示基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA):采用ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中一氧化氮(Nitric oxide，NO)，前列腺素E2(PGE2)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的濃度。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：將特異性抗體用包被緩沖液稀釋至最適濃度(1～10 μg/ml)，37 ℃水浴3 h。移去包被液，用洗滌緩沖液(含0.05 %Tween-20)洗3次，每次5 min。每孔加入0.2 ml含抗原的被檢標(biāo)本，37 ℃處理1～2 h。加入0.2 ml酶標(biāo)記特異性抗體溶液，37 ℃處理1～2 h。移去包被液，用洗滌緩沖液(含0.05 %Tween-20)洗3次，每次5 min。加入0.2 ml底物溶液于每個(gè)孔(OPD或OT)，室溫作用30 min。加終止劑：每孔加2 M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 ml。用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定OD(492 nm)值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.6 免疫印跡分析法蛋白表達(dá)：用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液從軟骨細(xì)胞中提取總蛋白， BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白在SDS-PAGE中被分離，然后被轉(zhuǎn)移至PVDF膜并在含5%脫脂牛奶的TBST封閉緩沖液孵育2h。加入一抗(1∶1000稀釋)在4 ℃冰箱中孵育過夜。次日，用含0.1% Tween-20的TBS洗滌3次，每次5 min，再與二抗(1∶5000稀釋)一起孵育膜2 h。最后，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白，并用Quantity ONE(BioRad, Hercules, CA, USA)軟件進(jìn)行定量。GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 IL-1β處理下調(diào)SNIP1表達(dá) 見圖1。研究發(fā)現(xiàn)，24 h的IL-1β(0、5、10、20 ng/ml)處理明顯降低NHAC-κn細(xì)胞活性(P<0.05，圖1A)；SNIP1的mRNA和蛋白表達(dá)水平也隨著IL-1β的濃度上升而下降(P<0.05，圖1B、C)。鑒于20 ng/ml IL-1β處理組NHAC-κn活性過低，因此選擇10 ng/ml IL-1β處理NHAC-κn細(xì)胞24 h進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.2 pcDNA3.1-SNIP1抑制IL-1β誘導(dǎo)的NHAC-κn細(xì)胞中的炎癥因子的表達(dá) 見圖2。pcDNA3.1-SNIP1轉(zhuǎn)染NHAC-κn細(xì)胞后，SNIP1表達(dá)顯著提高(P<0.05)(見圖2A﹑B)。利用ELISA法檢測(cè)IL-1β誘導(dǎo)的NHAC-κn細(xì)胞中NO、PGE2、IL-6、TNF-α的含量，分析SNIP1對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的NHAC-κn細(xì)胞中炎癥反應(yīng)的影響。過表達(dá)SNIP1的NHAC-κn細(xì)胞中NO、PGE2、IL-6、TNF-α含量均顯著低于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05，見圖2C～F)。

2.3 pcDNA3.1-SNIP1抑制IL-1β誘導(dǎo)的NHAC-κn細(xì)胞中iNOS、COX-2、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5的表達(dá) 通過免疫印跡分析實(shí)驗(yàn)，表達(dá)SNIP1顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的NHAC-κn細(xì)胞炎癥反應(yīng)中炎癥介質(zhì)(COX-2、iNOS)與分解代謝因子(MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5)的合成(P<0.05)，見圖3。

2.4 pcDNA3.1-SNIP1促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的NHAC-κn細(xì)胞中Collagen Ⅱ和Aggrecan的表達(dá) 見圖4。結(jié)果顯示，IL-1β處理顯著抑制NHAC-κn細(xì)胞外基質(zhì)成分Collagen Ⅱ和Aggrecan的表達(dá)，過表達(dá)SNIP1可部分逆轉(zhuǎn)IL-1β的抑制作用(P<0.05)。

2.5 pcDNA3.1-SNIP1抑制IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB p65和 IκB 磷酸化 見圖5。為探究SNIP1影響IL-1β誘導(dǎo)的NHAC-κn細(xì)胞的分子機(jī)制，我們用蛋白印跡法檢測(cè)了p-p65、p-IκB的表達(dá)。pcDNA3.1-SNIP1顯著抑制NF-κB通路，Betulinic acid可逆轉(zhuǎn)pcDNA3.1-SNIP1對(duì)p-p65、p-IκB蛋白水平的抑制作用，且可緩解SNIP1對(duì)炎癥因子(IL-6、TNF-α)的抑制作用(P<0.05)。

注：與未處理組比較，*P<0.05

注：與未處理組比較，*P<0.05；與IL-1β+pcDNA3.1組比較，#P<0.05

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，其特征是軟骨基質(zhì)的逐漸喪失和關(guān)節(jié)軟骨的破壞。隨著時(shí)間的推移，軟骨下骨增厚，滑膜內(nèi)產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)，最后，膝關(guān)節(jié)韌帶和半月板的退化導(dǎo)致關(guān)節(jié)囊肥大[9]。探索骨關(guān)節(jié)炎的治療靶標(biāo)對(duì)于改善患者的臨床癥狀并提高其生活質(zhì)量具有重要意義。

SNIP1在多種細(xì)胞和組織中均有表達(dá)，可調(diào)節(jié)不同的生物學(xué)進(jìn)程[10- 11]。例如，SNIP1在炎性腸病患者的外周血單核細(xì)胞和固有層單核細(xì)胞中的表達(dá)均顯著下調(diào)[12]。在活動(dòng)性克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎患者的黏膜上皮細(xì)胞中，SNIP1的表達(dá)也顯著降低，并使腸上皮細(xì)胞屏障功能受損[6]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們用10 ng/mlIL-1β處理NHAC-κn細(xì)胞24 h來構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞模型，結(jié)果顯示SNIP1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均下調(diào)。

注：與未處理組比較，*P<0.05；與IL-1β+pcDNA3.1組比較，#P<0.05

注：與未處理組比較，*P<0.05；與IL-1β+pcDNA3.1組比較，#P<0.05

注：與未處理組比較，*P<0.05；與IL-1β+pcDNA3.1組比較，P<0.05；與IL-1β+pcDNA3.1-SNIP1組比較，#P<0.05

IL-1β誘導(dǎo)iNOS產(chǎn)生過量的NO，從而刺激產(chǎn)生MMPs和PGE2等炎性細(xì)胞因子，并抑制膠原蛋白和蛋白多糖的合成[13]。PGE2能通過增強(qiáng)MMPs和其他炎性細(xì)胞因子活性介導(dǎo)軟骨基質(zhì)的降解[14]。越來越多的證據(jù)表明，抑制NO和PGE2等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生能夠緩解骨關(guān)節(jié)炎[15]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SNIP1顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO、PGE2、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5，并促進(jìn)Collagen Ⅱ和Aggrecan的合成，表明SNIP1可能緩解IL-1β處理導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)。

NF-κB信號(hào)通路是參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的主要分解代謝信號(hào)通路之一，在調(diào)節(jié)與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的炎癥介質(zhì)中起著關(guān)鍵作用[16]。炎癥介質(zhì)如IL-1β刺激使NF-κB從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)多種炎癥相關(guān)基因(iNOS、COX-2、PGE2和MMPs)的表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞中產(chǎn)生分解代謝因子，導(dǎo)致軟骨炎癥[17]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SNIP1抑制p-p65和p-IκB的表達(dá)，且NF-κB激活劑可逆轉(zhuǎn)pcDNA3.1-SNIP1對(duì)炎癥因子(IL-6、TNF-α)的抑制作用，提示SNIP1通過抑制NF-κB通路緩解軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

本研究表明，在10 ng/ml IL-1β處理的NHAC-κn細(xì)胞中，SNIP1表達(dá)顯著降低。過表達(dá)SNIP1會(huì)抑制炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的NO、PGE2、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5水平，促進(jìn)Collagen Ⅱ和Aggrecan合成。此外，SNIP1抑制NF-κB通路，NF-κB激活劑可以部分逆轉(zhuǎn)SNIP1對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的抑制作用。綜上，SNIP1可能通過抑制NF-κB通路緩解骨關(guān)節(jié)炎，為探索骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)理及治療方法提供了理論基礎(chǔ)。