郭 棟，魏 鵬，梁 剛，楊學(xué)超

(陜西核工業(yè)二一五醫(yī)院,陜西 咸陽 712000)

胃癌(Gastric cancer,GC)是胃腸道最常見的惡性腫瘤之一，我國胃癌每年的新確診人數(shù)約占世界范圍的40%以上，嚴(yán)重?fù)p害患者的身心健康[1]。近年來，雖然關(guān)于胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制研究已經(jīng)獲得了重大進(jìn)展，但是與胃癌患者預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物仍需進(jìn)一步研究[2-3]。原纖維蛋白-1(Fibrillin-1，F(xiàn)BN1)是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)微纖維的主要成分，其主要作用是保持結(jié)締組織的形態(tài)完整和功能正常[4]。據(jù)報道，卵巢癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、甲狀腺癌樣本中FBN1基因的表達(dá)量和拷貝數(shù)均明顯增多，且與患者預(yù)后密切相關(guān)[5-8]。本研究通過測定FBN1在胃癌及其配對癌旁組織中的表達(dá)水平及與患者預(yù)后的相關(guān)性，探討其在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月至2013年12月期間行胃癌根治術(shù)患者的石蠟包埋標(biāo)本100例，其中男54例，女46例；年齡38～76歲，平均(55.85±11.80)歲；中高分化44例，低分化56例；T1-T2 35例，T3-T4 65例；淋巴轉(zhuǎn)移49例，無淋巴轉(zhuǎn)移51例；Ⅰ-Ⅱ期36例，Ⅲ-Ⅳ期64例。另取距腫瘤邊緣>2 cm的配對癌旁組織100例作為對照。本研究經(jīng)陜西省核工業(yè)215醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。組織標(biāo)本經(jīng)患者本人知情簽字。 病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《消化系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)》制定的胃癌相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②術(shù)前均未進(jìn)行放化療；③所取配對癌旁組織無任何癌細(xì)胞浸潤；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前確診合并其他臟器有功能障礙性疾病或惡性腫瘤的患者；②術(shù)前服用影響研究指標(biāo)的藥物；③不接受隨訪；④免疫組化染色結(jié)果不佳。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑：兔抗人FBN1多克隆抗體購自上海恒斐生物科技有限公司，SP免疫組化試劑盒均購自武漢純度生物科技有限公司，DAB顯色試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.2.2 檢測方法：采用免疫組化SP法，切取100例胃癌及癌旁組織石蠟標(biāo)本，厚度5 μm；將組織石蠟塊在50 ℃溫水中展平，然后用處理干凈的載玻片撈片；68 ℃恒溫箱烤片2 h；常規(guī)脫蠟、水化；80%甲醇卵孵10 min后，將切片置入0.01 mol/L緩沖液(pH6.0)中，進(jìn)行水溶鍋煮沸，時間為20 min。隨后在室溫條件下，使用5%BSA封閉液開展孵育，時間為30 min，甩干后，滴加一抗50 μl(FBN1 濃度為1∶100)，于4 ℃條件下過夜。室溫下，將帶有HRP標(biāo)記的二抗50 μl加入后，靜置1 h。滴加SP，37 ℃卵育1 h；(以上各步驟間均用PBS沖洗3次，每次5 min)，隨后進(jìn)行DAB顯色，顯色時間為10 min。將標(biāo)本在水下進(jìn)行沖洗，沖洗時間為10 min，隨后使用蘇木精開展復(fù)染操作，時間為2 min。最后進(jìn)行常規(guī)的脫水、封片、鏡檢，在操作中對照采用PBS液代替一抗。

1.3 觀察指標(biāo) ① FBN1蛋白在胃癌和癌旁組織的表達(dá)：FBN1定位于胃癌組織細(xì)胞漿或胞膜，出現(xiàn)黃色顆粒為陽性染色，陽性表達(dá)率根據(jù)細(xì)胞染色強度和陽性細(xì)胞占比進(jìn)行計算。細(xì)胞染色強度計分標(biāo)準(zhǔn)：無顯色0分，黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。按光學(xué)顯微鏡下(×400)陽性細(xì)胞百分率計分，陽性細(xì)胞<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項分值相加≥3分為高表達(dá)，<3分為低表達(dá)。②不同F(xiàn)BN1蛋白表達(dá)水平胃癌患者的臨床病理特征分析： 臨床病理特征包括年齡、性別、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤直徑、腫瘤位置等。比較不同臨床病例特征患者的FBN1蛋白表達(dá)情況。③FBN1蛋白不同表達(dá)情況胃癌患者的生存分析：電話隨訪100例行胃癌根治術(shù)的患者，隨訪時間以手術(shù)當(dāng)天起至隨訪截止時間或患者死亡，隨訪截止時間為2019年5月31日。根據(jù)隨訪結(jié)果，比較FBN1蛋白高表達(dá)和低/陰性表達(dá)胃癌患者的生存時間。④影響胃癌患者術(shù)后生存的多因素分析：使用Cox回歸分析影響胃癌患者術(shù)后生存的獨立危險因素。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計數(shù)資料組間比較以[例(%)]表示，采用χ2檢驗。生存分析用 Kaplan-Meier，組間對比用Log-Rank 檢驗，使用Cox回歸分析影響胃癌患者術(shù)后生存的獨立危險因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FBN1蛋白在胃癌和癌旁組織的表達(dá) 胃癌組織中，F(xiàn)BN1蛋白陽性高表達(dá)61例，高表達(dá)率為61.00%，低表達(dá)31例，低表達(dá)率為31.00%，陰性表達(dá)8例，陰性表達(dá)率8.00%，陽性表達(dá)率92.00%。癌旁組織中FBN1蛋白高表達(dá)8例，高表達(dá)率8.00%，低表達(dá)32例，低表達(dá)率32.00%，陰性表達(dá)60例，陰性表達(dá)率60.00%，陽性表達(dá)率40.00%。胃癌組織中FBN1蛋白陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織(P<0.05)。FBN1在胃癌組織中陽性表達(dá)為腫瘤細(xì)胞漿或包膜有棕黃色顆粒，見圖1A；FBN1在癌旁組織中的陰性表達(dá)見圖1B。

A:胃癌組織FBN1陽性表達(dá)；B：癌旁組織FBN1陰性表達(dá)

2.2 不同F(xiàn)BN1蛋白表達(dá)水平胃癌患者的臨床病理特征分析 胃癌組織中FBN1蛋白高表達(dá)患者的胃癌浸潤深度T3-T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期發(fā)生率明顯高于FBN1蛋白低/陰性表達(dá)患者(P<0.05)。胃癌組織中FBN1蛋白高表達(dá)患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤直徑、腫瘤位置與FBN1蛋白低/陰性表達(dá)患者相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同F(xiàn)BN1蛋白表達(dá)水平胃癌患者的臨床病理特征分析[例(%)]

2.3 FBN1蛋白不同表達(dá)情況胃癌患者的生存分析 100例胃癌患者均獲得有效隨訪，隨訪時間2～65個月，中位隨訪時間33個月，隨訪過程中46例因胃癌死亡。FBN1蛋白高表達(dá)患者生存時間(35.30±2.70)個月，F(xiàn)BN1蛋白低/陰性表達(dá)患者平均生存時間(52.69±3.12)個月，經(jīng)Log-Rank檢驗，F(xiàn)BN1蛋白高表達(dá)患者生存時間顯著低于FBN1蛋白低/陰性表達(dá)患者(P<0.05)。見圖2。

圖2 FBN1蛋白不同表達(dá)情況胃癌患者的生存分析

2.4 影響胃癌患者術(shù)后生存的多因素分析 Cox回歸分析顯示，F(xiàn)BN1蛋白高表達(dá)、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、低分化以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均為影響胃癌患者術(shù)后生存的獨立危險因素。見表2。

表2 影響胃癌患者術(shù)后生存的多因素分析

3 討 論

胃癌屬于世界上發(fā)生率較高的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害者人類的身體健康，研究胃癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，并進(jìn)行有效的治療在臨床中意義重大[9]。然而，由于早期胃癌的隱匿性和民眾篩查意識的缺乏，導(dǎo)致大多數(shù)胃癌患者確診時疾病已發(fā)展到進(jìn)展期。胃癌根治術(shù)仍是臨床中對患者的主要推薦治療方法，能夠改善患者臨床癥狀，延緩病情進(jìn)展。但是研究發(fā)現(xiàn)，由于胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高，導(dǎo)致患者整體預(yù)后差、生存期較短[10-11]。近年來，靶向藥物作為惡性腫瘤患者的補充治療手段日漸備受重視[12]。因此，尋找新的藥物靶點，改善胃癌患者預(yù)后及延長其生存期成為當(dāng)今轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的熱點。

原纖維蛋白(FBN)被發(fā)現(xiàn)參與了癌癥的發(fā)病機(jī)制[13]。原纖維蛋白家族(FBN)由FBN1、FBN2、FBN3、FBN4等4個成員組成，主要分布于結(jié)締組織中，屬于細(xì)胞外基質(zhì)中微纖維的主要成分[14]。FBN1作為纖維蛋白家族成員之一，是由位于常染色體15q21.1區(qū)域，長約230 kb，含有65個外顯子的基因編碼的是一個很大的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，可以形成細(xì)長的絲狀體,微纖維,它可以為組織提供結(jié)構(gòu)支撐,形成皮膚彈性纖維和血管及儲存轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)蛋白[15]。一系列研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BN1主要作為促癌因子在眾多腫瘤組織中廣泛表達(dá)，通過Wnt/β-catenin信號通路及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換途徑影響胃癌的發(fā)生發(fā)展，其表達(dá)程度遠(yuǎn)高于相對應(yīng)的正常組織，其表達(dá)水平及拷貝量的變化有可能與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展存在關(guān)系，包括：結(jié)腸癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌及膽管癌等[16-17]。目前FBN1在眾多腫瘤組織中的過表達(dá)已有報道，然而有關(guān)FBN1在胃癌領(lǐng)域的研究報道甚少，通過胃癌中FBN1蛋白的研究能夠擴(kuò)充FBN1在腫瘤中的研究領(lǐng)域，而且有望發(fā)現(xiàn)胃癌新的標(biāo)記物及治療的新靶標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)FBN1蛋白主要在胃癌組織細(xì)胞中的胞質(zhì)和或胞膜中表達(dá)，且FBN1在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于配對癌旁組織(P<0.05)，研究結(jié)果與倪曉飛等[15]研究結(jié)果一致。Zhang等[18]也發(fā)現(xiàn)FBN1表達(dá)上調(diào)可能提示卵巢癌的早期復(fù)發(fā)和對鉑類化療的敏感性。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)FBN1促進(jìn)卵巢癌轉(zhuǎn)移。Guo等[20]發(fā)現(xiàn) FBN1啟動子的甲基化狀態(tài)是結(jié)腸直腸癌的一種高特異性、敏感的生物標(biāo)志物。此外，本研究通過對FBN1蛋白表達(dá)情況與患者病理特征的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)FBN1蛋白的高表達(dá)和胃癌浸潤T3-T4、TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，具有明顯的相關(guān)性，但與患者性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤直徑等因素?zé)o關(guān)。且腫瘤的浸潤程度越深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越高，則患者FBN1蛋白的陽性表達(dá)水平越高，這說明FBN1可能作為一種促癌基因在胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。但是FBN1在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的具體機(jī)制仍需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步分析研究。

此外，對胃癌患者的預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BN1蛋白高表達(dá)的胃癌患者生存時間明顯低于FBN1蛋白低/陰性表達(dá)的患者，且FBNI蛋白高表達(dá)為影響胃癌患者術(shù)后生存的獨立危險因素，提示FBN1水平的上調(diào)可導(dǎo)致胃癌患者生存期變短，F(xiàn)BN1可作為判斷胃癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。然而，關(guān)于FBN1與胃癌患者預(yù)后判斷中的應(yīng)用價值還需深入研究。

綜上所述，F(xiàn)BN1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)，并可作為胃癌患者術(shù)后生存時間的評估指標(biāo)。然而未來仍需開展更進(jìn)一步的深入研究，以明確FBN1蛋白在胃癌預(yù)后判斷和治療方案指導(dǎo)中的意義。