茍圣松，林亞秋，王 永，朱江江,3*

（1.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，四川成都 610041；3.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川成都 610041）

肌內(nèi)脂肪是影響山羊肉品質(zhì)的重要因素，篩選并鑒定山羊脂質(zhì)代謝調(diào)控的關鍵基因是目前山羊分子育種的重要手段。PNPLA3（Patatin Like Phospholipase Domain-Containing 3）是由位于人22 號染色體上的PNPLA3基因所編碼的一種非分泌性多功能蛋白，由481 個氨基酸組成，最初被鑒定為一種高脂肪特異性轉(zhuǎn)錄物，同時具有甘油三酯脂肪酶和?；视娃D(zhuǎn)?；傅幕钚?，能夠快速地參與營養(yǎng)調(diào)節(jié)[1]，主要參與脂肪的積累和動員[2]，被稱為脂肪滋養(yǎng)蛋白。PNPLA3基因在人類各組織中均表達，在肝臟和脂肪組織表達豐度最高[3-4]。

已有研究表明，PNPLA3可調(diào)節(jié)肝臟中糖脂代謝[5]。脂質(zhì)代謝中許多基因的轉(zhuǎn)錄控制是通過固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）途徑進行調(diào)控的。PNPLA3是SREBP-1c的靶基因[6]，SREBP-1c可通過肝X 受體/類視黃醇X 受體（LXR/RXR）途徑的激活進而影響PNPLA3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外，有研究證實PNPLA3可在轉(zhuǎn)錄后水平上通過SREBP-1c途徑的終產(chǎn)物脂肪酸進行營養(yǎng)調(diào)節(jié)[7]。全基因組關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)PNPLA3中的1個等位基因（rs738409[G]，編碼I148M）突變與肝臟脂肪水平升高、肝炎以及肝纖維化密切相關，為非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）的主要易感因素[8-9]。然而目前PNPLA3在山羊脂質(zhì)代謝中的研究較少。

簡州大耳羊是用努比羊與四川省簡陽市當?shù)厣窖螂s交選育而形成的我國第2 個肉用山羊新品種，具有肉質(zhì)優(yōu)良、膽固醇含量低、營養(yǎng)豐富等特點[10-11]。本研究以簡州大耳羊為研究對象，利用T-A 克隆技術(shù)獲得山羊PNPLA3基因序列并進行生物信息學分析，為進一步闡明PNPLA3基因在調(diào)控山羊脂質(zhì)代謝中的作用及分子機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與組織采集 于四川省簡陽市大哥大牧業(yè)有限公司隨機挑選3 只1 周歲無遺傳相關性的健康簡州大耳羊公羊，空腹頸動脈放血致死，無菌采集各山羊背部皮下脂肪組織，用0.1% DEPC 水沖洗干凈裹上錫箔紙后裝入凍存管，迅速放入液氮內(nèi)帶回實驗室，等比例混合后用于提取組織總RNA。

1.1.2 主要試劑 試劑主要包括Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo 公司，美國）、2×LongTaqPCR Master Mix、瓊脂糖、膠回收試劑盒（QIAGEN 公司，德國）、DNA Marker DL2000、loading buffer 6x、pMD-19T（擎科生物科技有限公司，成都）、大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α（天根生化科技有限公司，北京）。

1.2 實驗方法

1.2.1 組 織RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄及PCR 擴增采用Trizol 法提取組織總RNA，用核酸蛋白濃度檢測儀檢測其濃度（ng/μL）及OD 值（OD260/OD280在1.8～2.0符合要求）。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物由成都擎科生物科技有限公司合成。根據(jù)NCBI 上山羊PNPLA3基因的預測序列（登錄號：XM_005709739.3），利用Primer Premier 5 軟件設計PCR 克隆引物，PNPLA3-F：5'-CCAACCTGCCGCCGC TAT-3'；PNPLA3-R：5'-CCAGCCGAGCCAACGATA C-3'，預測PCR 產(chǎn)物片段大小為1 564 bp。PCR 反應體系：2×Long Taq PCR Master Mix 12.5 μL，模板cDNA 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，最后加ddH2O 至25 μL。擴增條件：98℃預變性4 min；98℃變性20 s，68℃退火20 s，72℃延伸90 s，18 個循環(huán)；98℃變性20 s，53℃退火20 s，72℃延伸90 s，17 個循環(huán)；72℃延伸5 min；PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，按膠回收試劑盒說明書回收目的片段。

1.2.2 山羊PNPLA3基因克隆及測序 將目的基因與pMD-19T 載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性單克隆菌落于1.5 mL LB 液體培養(yǎng)基中以37℃、180 r/min 擴大培養(yǎng)3～6 h，經(jīng)菌液PCR 鑒定正確后送到成都擎科生物科技有限公司測序。

1.2.3 山羊PNPLA3基因序列分析 利用NCBI 網(wǎng)站中的ORF Finder 對所得到的序列進行開放式閱讀框預測，獲取其氨基酸序列，DNAMAN 進行氨基酸序列同源性對比；用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建進化樹；利用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）進行信號肽分析；運用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）在線分析PNPLA3 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；使用TMHMM2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；應用NetPhos3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在 線分析PNPLA3 蛋白磷酸化位點；STRING 交互式數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）進行蛋白相互作用分析；通過SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）在線分析PNPLA3 蛋白的二級結(jié)構(gòu)；SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/） 在 線分析PNPLA3 蛋白的三級空間構(gòu)型。

2 結(jié)果

2.1 山羊PNPLA3基因克隆 以簡州大耳羊皮下脂肪組織cDNA 為模板用于PCR 擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測后得到單一明亮條帶，且大小與預期片段相符。經(jīng)測序獲得PNPLA3基因序列1 564 bp（圖1），其中包括CDS 區(qū)1 344 bp，5'UTR 序列234 bp和3'UTR 序列49 bp，編碼447 個氨基酸殘基，上傳至NCBI 獲得登錄號：MN643056。

圖1 PNPLA3 基因克隆

2.2 PNPLA3 氨基酸同源性分析 利用DNAMAN 將獲得的山羊PNPLA3 氨基酸序列與其他物種進行比對發(fā)現(xiàn)，山羊PNPLA3 氨基酸序列與綿羊（XM_027968188.1）、牛（XM_024992822.1）、大鼠（NM_001282324.1）、小鼠（NM_054088.3）和人（NM_025225.3）的序列同源性分別為83.89%、81.21%、56.38%、56.15%、58.42%（圖2）。構(gòu)建的氨基酸序列系統(tǒng)進化樹（圖3）顯示，PNPLA3蛋白在各物種進化上相對保守，尤其與綿羊親緣關系最近，其次為牛、豬、人、小鼠、大鼠，而與原雞的親緣關系最遠。

圖2 PNPLA3 氨基酸序列同源性對比

圖3 利用MEGA 5.0 構(gòu)建山羊PNPLA3 氨基酸序列系統(tǒng)進化樹

2.3PNPLA3基因生物信息學分析 ExPASy 在線工具對山羊PNPLA3基因編碼的氨基酸序列進行理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白分子式為C2230H3485N595O639S23，分子質(zhì)量為49.592 ku，理論等電點為6.07，不穩(wěn)定指數(shù)為49.40，親水性總平均值為0.049，說明為不穩(wěn)定疏水酸性蛋白（圖4）。利用SignalP 4.1 Server 進行信號肽分析，結(jié)果顯示無信號肽序列（圖5）。利用SMART 和ScanProsite 軟件預測蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白有2 個跨膜結(jié)構(gòu)域，分別為Leu10-Ser30 和Phe43-Leu62。其中Leu10-Lys179 為PNPLA 家族同源結(jié)構(gòu)域（圖6）。蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本的機制，利用NetPhos 3.1 軟件對PNPLA3 蛋白進行磷酸化位點分析，結(jié)果顯示該蛋白有18 個絲氨酸、3 個蘇氨酸、3 個酪氨酸磷酸化位點（圖7）。用STRING數(shù)據(jù)庫檢索到PNLIP、PNPLA2、LIPC、PNLIPRP3、LPL、AGK、MGLL 等蛋白可能與PNPLA3 蛋白存在相互作用關系（圖8）。山羊PNPLA3 蛋白三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預測一致，α螺旋、無規(guī)則卷曲、β折疊和β轉(zhuǎn)角分別占比44.07%、39.6%、10.51%、5.82%（圖9）。用PSORT Ⅱ進行亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要在線粒體（30.4%）、細胞質(zhì)（30.4%）和高爾基體（13.0%）中發(fā)揮生物學作用。

圖4 山羊PNPLA3 蛋白質(zhì)的親疏水性的預測

圖5 山羊PNPLA3 蛋白的信號肽分析

圖6 山羊PNPLA3 蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域分析

圖7 山羊PNPLA3 蛋白的磷酸化位點預測

圖8 綿羊PNPLA3 蛋白相互作用蛋白預測

3 討 論

圖9 PNPLA3 蛋白結(jié)構(gòu)預測

本實驗通過基因克隆技術(shù)獲得山羊PNPLA3基因序列1 564 bq，其中CDS 區(qū)1 344 bp，編碼447 個氨基酸，對比不同物種PNPLA3基因CDS 區(qū)序列得知，多數(shù)變異為堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，僅有少數(shù)位點發(fā)生堿基的插入或缺失。與NCBI 上山羊預測cDNA 序列相比較，山羊PNPLA3基因存在2 個突變位點，第1 149 位核苷酸由胸腺嘧啶突變成為胞嘧啶，第1 249 位發(fā)生插入突變，插入了鳥嘌呤堿基。此外，對比山羊和牛的PNPLA3 氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，山羊PNPLA3 416 位插入了天冬氨酸，這是由于其PNPLA3 編碼區(qū)序列1 249 bp 處插入了鳥嘌呤堿基，導致終止密碼子TGA 后移21 bp，多編碼7 個氨基酸。構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹表明，山羊與綿羊的親緣關系最近。

PNPLA3編碼區(qū)序列分析顯示，人和小鼠PNPLA3序列同源性為68%。人PNPLA3編碼481 個氨基酸，小鼠PNPLA3編碼384 個氨基酸。在小鼠中，PNPLA3在白色和棕色脂肪細胞中高度表達，在肝臟中適度表達[5]。然而，在人體中，PNPLA3在肝臟中的表達是脂肪組織的10 倍[12]。研究表明，人PNPLA3 I148M 基因突變與肝臟甘油三酯含量增加密切相關[12]。然而，含有PNPLA3 I148 M 突變基因的小鼠肝臟中甘油三酯含量與野生型小鼠無顯著差異。PNPLA3基因敲除的小鼠并不表現(xiàn)肝臟甘油三酯積聚，因此不會發(fā)生脂肪變性，且過度表達人PNPLA3基因的小鼠具有與野生型小鼠相似的甘油三酯水平。有報道認為PNPLA3 在二級結(jié)構(gòu)的基礎上具有跨膜結(jié)構(gòu)域，且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴密切相關[13]，這與本實驗的分析結(jié)果有異曲同工之處。PNPLA3 蛋白三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示，山羊、綿羊、牛、大鼠、小鼠的蛋白三級結(jié)構(gòu)具有高度相似性，而人PNPLA3 蛋白三級結(jié)構(gòu)與上述物種有著明顯差異，這可能是導致PNPLA3 蛋白在人和小鼠中表現(xiàn)出功能差異的直接原因，目前暫未見山羊、綿羊、牛的相關報道。STRING 數(shù)據(jù)庫檢索到PNPLA3 蛋白與PNPLA2、LPL、PNLIP、LIPC 蛋白存在相互作用。有研究表明，PNPLA2 具有三酰甘油水解酶和酰基甘油轉(zhuǎn)酰酶活性，LPL 在甘油三酯代謝中起重要調(diào)控作用，PNLIP 具有甘油三酯水解酶的活性，LIPC 也與脂肪代謝密切相關，且PNPLA2、LPL 已被證實與山羊肌肉生長發(fā)育，脂肪沉積能力相關[13-15]。因此推測PNPLA3可能與山羊脂質(zhì)代謝調(diào)控密切相關。

目前，PNPLA3基因多態(tài)性與非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）的關聯(lián)性研究是一個熱點與難點。PNPLA3中的一個等位基因（rs738409[G]，編碼I148M）突變使得148 位氨基酸異亮氨酸轉(zhuǎn)化為蛋氨酸,蛋氨酸將阻止底物結(jié)合到有催化活性的47 位氨基酸絲氨酸上，從而使其喪失脂肪?；饣钚訹16]，進而導致肝臟脂肪變性和代謝紊亂。相關研究也表明PNPLA3-I148M能通過限制甘油三酯水解來促進甘油三酯的積累進而增加肝臟脂肪蓄積[17]。近年來，越來越多的證據(jù)表明PNPLA3-I148M 多態(tài)性在肝癌發(fā)病中具有獨立的傾向性，肝細胞癌患者存在嚴重的肝纖維化[18]。同時，PNPLA3突變在肥胖人群中的作用被放大，使之對肝癌的易感性增高[19]。因此，PNPLA3rs738409 可用于更好地了解易感人群患肝病的風險，并做出早期的預防策略。已有研究表明，SREBP-1c和ChREBP2個轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控PNPLA3基因的表達。ChREBP是葡萄糖代謝過程中的重要調(diào)控因子，葡萄糖攝入能上調(diào)人肝臟細胞PNPLA3mRNA 的表達，且ChREBP作為關鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子參與介導了這種上調(diào)[20]。此外，PNPLA3已被報道為SREBP-1c的靶基因，SREBP-1c可通過結(jié)合到大鼠PNPLA3啟動子區(qū)進而激活PNPLA3基因轉(zhuǎn)錄。敲除小鼠SREBP-1c基因，飽食后肝臟中甘油三酯和脂肪酸的合成減少，而敲低小鼠PNPLA3能部分抑制通過SREBP-1c 途徑引起的甘油三酯的聚集[21-23]。目前暫未見PNPLA3在山羊肌肉生長發(fā)育中分子調(diào)控機制的相關報道，本實驗為此提供了基礎資料。

4 結(jié) 論

本研究克隆了山羊PNPLA3基因，獲得其序列1 564 bp，其中CDS 區(qū)1 344 bp，編碼447 個氨基酸殘基，GenBank 登錄號為MN 643056；山羊PNPLA3 氨基酸序列與綿羊、牛、大鼠、小鼠和人的氨基酸序列同源性分別達到83.89%、81.21%、56.38%、56.15%、58.42%；與綿羊親緣關系最近，其次為牛、豬、人、小鼠、大鼠、原雞，并預測與PNPLA2、LPL 等脂質(zhì)代謝調(diào)控相關蛋白具有相互作用。