盧永康，陳窕圓，莊賢勉，李健，姜小艷，徐思思，黃彥子，黃彬

基于調(diào)節(jié)腸道菌群失衡的四君子湯干預(yù)心力衰竭大鼠機(jī)制研究

盧永康1，陳窕圓2，莊賢勉1，李健2，姜小艷2，徐思思2，黃彥子2，黃彬2

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518000；2.深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518000

從調(diào)節(jié)腸道菌群角度探討四君子湯對心力衰竭大鼠的作用機(jī)制。40只雄性Wistar大鼠分為假手術(shù)組、模型組、四君子湯組及益生菌組，每組10只。采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法制備心力衰竭大鼠模型，心電圖及TTC、HE染色確定心肌梗死情況，HE染色檢測腸黏膜結(jié)構(gòu)變化，治療前后超聲評估心功能，并于治療后行高通量測序檢測腸道菌群的變化。心肌HE染色顯示，模型組心肌細(xì)胞較假手術(shù)組數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)萎縮，肌纖維疏松；結(jié)腸HE染色顯示，模型組大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞排列紊亂，絨毛萎縮、粘連，隱窩減少、排列不規(guī)則，腺體正常結(jié)構(gòu)消失、呈空泡狀。超聲結(jié)果顯示，治療前與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌明顯變薄，心腔增大，左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）顯著增加，左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）顯著減少（＜0.001）；治療后與模型組比較，四君子湯組大鼠LVEDd、LVESd顯著減少（＜0.001），LVEF顯著增加（＜0.001）。測序結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠出現(xiàn)腸道菌群失衡：在門分類水平，表現(xiàn)為厚壁菌門豐度顯著減少（＜0.001），擬桿菌門及疣微菌門豐度顯著增加（＜0.001，＜0.05）；在屬分類水平，表現(xiàn)為乳桿菌屬、厭氧芽孢桿菌屬豐度顯著減少（＜0.001，＜0.05），菌屬、艾克曼菌屬豐度顯著增加（＜0.001，＜0.05）。與模型組比較，四君子湯組大鼠腸道菌群失衡顯著改善：在門分類水平，厚壁菌門豐度顯著增加，擬桿菌門豐度顯著減少（＜0.05）；在屬分類水平，乳桿菌屬、厭氧芽孢桿菌屬豐度顯著增加，菌屬豐度顯著減少（＜0.05）。四君子湯通過調(diào)節(jié)腸道菌群失衡，對大鼠心肌梗死后心力衰竭有一定的治療作用。

心力衰竭；腸道菌群；四君子湯；中藥；大鼠

心力衰竭是心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致心室充盈或射血功能受損的復(fù)雜臨床綜合征，其病因分為缺血性和非缺血性兩大類，缺血性心臟病目前是心力衰竭的主要病因之一。近年來，關(guān)于腸道菌群與心力衰竭相關(guān)性研究受到重視，調(diào)節(jié)腸道菌群有望成為治療心力衰竭的新療法[1-2]。四君子湯出自《太平惠民和劑局方》，由人參、白術(shù)、茯苓、甘草組成，具有益氣健脾功效，常用于治療慢性胃炎、消化性潰瘍等。研究表明，四君子湯可通過改善腸屏障功能[3]、調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)[4-5]發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。臨床研究表明，四君子湯加減對心力衰竭有一定的療效[6-7]。四君子湯能否通過調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)揮治療心力衰竭的作用，目前尚無明確動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究通過建立心力衰竭大鼠模型，研究四君子湯對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，探討其治療心力衰竭的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級Wistar大鼠40只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號SYXK（粵）2018-0002。飼養(yǎng)于溫度25 ℃、相對濕度40%～60%環(huán)境，12 h光暗循環(huán)，常規(guī)飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2 藥物及制備

四君子湯（人參、白術(shù)、茯苓各9 g，甘草6 g）, 飲片購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院，常規(guī)煎煮2次，合并煎液并濃縮至含原藥材0.3 g/mL。復(fù)方乳酸桿菌片，通化金馬藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號20190810，配制成0.14 g/mL復(fù)方乳酸桿菌溶液。

1.3 主要試劑與儀器

TTC染色液（武漢博士德生物工程有限公司），蘇木素-伊紅染色液（武漢博士德生物工程有限公司）。Sonix TOUCH超聲診斷系統(tǒng)（加拿大超聲醫(yī)療技術(shù)有限公司），RM6240E/EC多道生理信號采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠），DW-3000B小動(dòng)物人工呼吸機(jī)（廣州必特生物科技有限公司）。

1.4 分組及造模

40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、四君子湯組、益生菌組，每組10只。按照文獻(xiàn)[8]方法，采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法制備心肌梗死后心力衰竭模型。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥（45 mL/kg）麻醉，仰臥位固定并行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，潮氣量6 mL，頻率80次/min。于左胸第3肋間沿肋骨走向開胸，暴露心臟，以左冠狀靜脈為標(biāo)志，找到冠狀動(dòng)脈前降支并以5-0縫線結(jié)扎，結(jié)扎位置以下心室前壁變白，收縮力減弱，心電圖見ST段抬高，表明出現(xiàn)心肌梗死，隨后關(guān)胸并繼續(xù)飼養(yǎng)2周，以超聲檢測其心功能可見明顯下降，表示心力衰竭模型制備成功。假手術(shù)組除不結(jié)扎前降支外，其余處理同模型組。

1.5 給藥

給藥劑量按照人和大鼠體表面積進(jìn)行等效劑量折算，四君子湯組予0.693 g/（kg?d）四君子湯煎液，益生菌組予0.32 g/（kg?d）復(fù)方乳酸桿菌溶液，假手術(shù)組及模型組予等量生理鹽水，連續(xù)14 d。

1.6 TTC染色

冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎后24 h，各組隨機(jī)抽取1只大鼠處死，取左心室，切片（2 mm），以TTC染色液浸泡，37 ℃避光15 min，觀察心肌梗死情況。

1.7 HE染色

模型制備成功后，各組隨機(jī)抽取1只大鼠處死，取左心室，距肛門約5 cm處取約0.5 cm結(jié)腸組織，4 ℃、4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色觀察左心室及結(jié)腸黏膜病理形態(tài)。

1.8 超聲心動(dòng)圖

治療前后大鼠進(jìn)行超聲檢查。大鼠麻醉后仰臥位固定，將超聲探頭置于大鼠心前區(qū)，選取胸骨旁左室長軸切面及腹主動(dòng)脈長軸切面，探頭頻率5 MHz，以M型超聲測量左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）和左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd），系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.9 生物信息學(xué)分析

治療結(jié)束后處死剩余大鼠，距肛門約5 cm處結(jié)腸內(nèi)取糞便1粒置于凍存管，-80 ℃冰箱保存，隨后進(jìn)行測序（委托上海市凌恩生物科技有限公司代為進(jìn)行）。測序技術(shù)：Illumina 250 MiSeq高通量測序平臺；測序模式：微生物組細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)測序。使用QIIME程序?qū)y序得到的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，然后用uParse軟件對有效數(shù)據(jù)在97%水平進(jìn)行操作分類單元聚類分析（分類水平包括域、界、門、綱、目、科、屬、種），本文主要在門、屬2個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)分析菌群結(jié)構(gòu)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 急性心肌梗死評價(jià)

冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎前大鼠心電圖正常，ST段未見明顯抬高，結(jié)扎后可見ST段明顯抬高，見圖1。術(shù)中肉眼可見其所支配范圍的心肌由紅色變?yōu)榘咨?，室壁運(yùn)動(dòng)減弱。

TTC染色結(jié)果顯示，大鼠正常心肌組織染成紅色，梗死區(qū)呈白色，見圖2。提示前降支結(jié)扎后發(fā)生急性心肌梗死。

注：a.結(jié)扎前；b.結(jié)扎后即刻

注：a.正常大鼠；b.心肌梗死大鼠

2.2 HE染色結(jié)果

心肌HE染色結(jié)果顯示，模型組心肌細(xì)胞較假手術(shù)組數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)萎縮，肌纖維疏松，見圖3。結(jié)腸HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，絨毛排列整齊、致密，模型組大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞排列紊亂，絨毛萎縮、粘連，隱窩減少、排列不規(guī)則，腺體正常結(jié)構(gòu)消失、呈空泡狀，提示心肌梗死發(fā)生后，其腸道內(nèi)環(huán)境明顯改變，見圖4。

圖3 大鼠心肌組織形態(tài)（HE染色）

圖4 大鼠結(jié)腸組織形態(tài)（HE染色）

2.3 心功能變化

二維超聲及M型超聲顯示，模型組大鼠心肌明顯變薄，心腔明顯增大，見圖5。各組大鼠治療前后心功能指標(biāo)結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，治療前模型組、四君子湯組及益生菌組LVEDd、LVESd明顯增加，LVEF明顯減少（＜0.001）；治療后四君子湯組和益生菌組LVEDd、LVESd、LVEF與假手術(shù)組比較差異雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.001），但可見四君子湯組LVEDd、LVESd、LVEF呈改善趨勢；與模型組治療后比較，四君子湯組LVEDd、LVESd均明顯減少，LVEF明顯增加（＜0.001），益生菌組各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見表1。

圖5 大鼠超聲心動(dòng)圖

表1 各組大鼠治療前后心功能指標(biāo)比較（±s）

注：與假手術(shù)組治療前比較，**＜0.001；與假手術(shù)組治療后比較，△△＜0.001；與模型組治療后比較，##＜0.001

2.4 腸道菌群多樣性分析

在門分類水平，各組大鼠腸道菌群相對豐度較高的5個(gè)菌門依次為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria），見圖6。假手術(shù)組腸道優(yōu)勢菌群主要為厚壁菌門及擬桿菌門，以厚壁菌門為主，約為擬桿菌門5倍。與假手術(shù)組比較，其余3組厚壁菌門豐度減少（＜0.001），擬桿菌門和疣微菌門豐度增加（＜0.001，＜0.05）；與模型組比較，四君子湯組厚壁菌門豐度增加，擬桿菌門豐度減少（＜0.05），見表2。提示心力衰竭大鼠存在腸道菌群失衡，在門分類水平，主要表現(xiàn)為厚壁菌門豐度顯著減少，擬桿菌門及疣微菌門豐度顯著增加，經(jīng)四君子湯治療后，菌群失衡情況有所改善。

注：sham-1～sham-8.假手術(shù)組；model-1～model-8.模型組；SJZT-1～SJZT-8.四君子湯組；YSJ-1～YSJ-8.益生菌組

表2 各組大鼠腸道菌群門水平豐度比較（±s，%）

注：與假手術(shù)組比較，*＜0.05，**＜0.001；與模型組比較，#＜0.05

在屬分類水平，所有大鼠腸道菌群相對豐度前5位分別為乳桿菌屬（，屬厚壁菌門）、菌屬（屬擬桿菌門）、艾克曼菌屬（，屬疣微菌門）、厭氧芽孢桿菌屬（，屬厚壁菌門）、普雷沃氏菌屬（，屬擬桿菌門），見圖7、圖8。與假手術(shù)組比較，其余3組大鼠乳桿菌屬豐度減少，菌屬、艾克曼菌屬豐度增加（＜0.05，＜0.001），四君子湯組厭氧芽孢桿菌屬豐度與假手術(shù)組相比無明顯差異（＞0.05），而模型組及益生菌組該菌屬豐度明顯減少（＜0.05）；與模型組比較，四君子湯組大鼠乳桿菌屬、厭氧芽孢桿菌屬豐度增加，菌屬豐度減少（＜0.05），艾克曼菌屬豐度雖較模型組減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；益生菌組與模型組比較，各菌屬豐度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見表3。提示心力衰竭大鼠存在腸道菌群失衡，在屬分類學(xué)水平主要表現(xiàn)為乳桿菌屬、厭氧芽孢桿菌屬豐度減少，菌屬、艾克曼菌屬豐度增加，經(jīng)四君子湯治療后，菌群失衡有所改善，乳桿菌屬及厭氧芽孢桿菌屬豐度較模型組增加，厭氧芽孢桿菌屬豐度恢復(fù)至正常水平，菌屬豐度減少，乳桿菌屬及菌屬豐度與假手術(shù)組比較仍存在差異，但較模型組改善。

圖7 各組大鼠腸道菌群屬水平主要構(gòu)成分析

圖8 各組大鼠腸道菌群屬水平構(gòu)成

表3 各組大鼠腸道菌群屬水平豐度比較（±s，%）

注：與假手術(shù)組比較，*＜0.05，**＜0.001；與模型組比較，#＜0.05

3 討論

腸道菌群對心力衰竭的影響已有一定的研究基礎(chǔ)，經(jīng)典的“心-腸”理論認(rèn)為心力衰竭導(dǎo)致腸道灌注不足、腸道屏障功能受損、細(xì)菌及內(nèi)毒素移位、腸道代謝失衡等，最終引起腸道菌群失衡[1]。對心力衰竭患者行結(jié)腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)，其腸黏膜形態(tài)與結(jié)構(gòu)較正常人群不同，腸壁增厚、水腫明顯，腸黏膜通透性增加[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭大鼠腸黏膜細(xì)胞排列紊亂，絨毛萎縮、粘連，隱窩減少、排列不規(guī)則，腺體正常結(jié)構(gòu)消失、呈空泡化，這可能是導(dǎo)致腸道菌群失衡的關(guān)鍵原因。正常情況下，在門分類水平，大鼠腸道優(yōu)勢菌群為厚壁菌門及擬桿菌門，兩者比例約為5∶1，當(dāng)心力衰竭發(fā)生后，厚壁菌門比例明顯下降，擬桿菌門、疣微菌門等比例明顯增加。這與臨床上對心力衰竭患者腸道菌群的分析結(jié)果一致[10-12]。

目前認(rèn)為，腸道菌群主要從炎癥及代謝失衡方面參與并影響心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。前者由于菌群失衡引起條件致病菌增加，腸道黏膜屏障破壞，循環(huán)中脂多糖、肽聚糖等促炎介質(zhì)增加[13]，引起全身性炎癥反應(yīng)，對心肌細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用[14]；后者則因?yàn)檎＞寒a(chǎn)生大量有助于人體消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)的酶系，也能產(chǎn)生如短鏈脂肪酸、膽汁酸及多種維生素等，在腸道細(xì)胞營養(yǎng)支持、維持腸道黏膜屏障功能、局部抗炎、調(diào)節(jié)免疫等方面起重要作用[15-16]。

以調(diào)節(jié)腸道菌群為靶點(diǎn)治療各種心血管疾病，如高血壓、血脂異常及心力衰竭等，受到廣泛關(guān)注。常見的治療手段包括飲食調(diào)節(jié)、糞菌移植、益生菌/益生元及抗生素等。補(bǔ)充外源性益生菌/益生元作為治療手段，目前仍存在爭議。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，益生菌治療心力衰竭大鼠，具有改善心室重構(gòu)和心功能的作用[17]，但也有臨床研究表明，服用益生菌/益生元后并無相應(yīng)效果[18]。在本研究中，益生菌組大鼠腸道菌群失衡及心功能未見改善，這可能與胃酸對外源性活菌殺滅作用及外源性活菌在腸道定植力不足等因素相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯能增加大鼠腸道厚壁菌門豐度，降低擬桿菌門豐度，增加乳桿菌屬、厭氧芽孢桿菌屬豐度，降低菌屬豐度，調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群失衡。同時(shí)，經(jīng)四君子湯治療后，大鼠心功能較模型組明顯改善，推測其機(jī)制之一可能為腸道中厚壁菌將食物中纖維轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸，這是腸黏膜細(xì)胞能量來源之一。厚壁菌豐度增加，有助于改善腸黏膜細(xì)胞能量供應(yīng)，增強(qiáng)其屏障功能，同時(shí)抑制腸道及機(jī)體炎癥反應(yīng)[15]；心力衰竭患者體內(nèi)氧化三甲胺水平明顯升高并與不良預(yù)后相關(guān)[19]，而乳桿菌可通過促進(jìn)膽汁酸生成進(jìn)而減少氧化三甲胺生成[20]。

本研究表明，四君子湯可通過調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群失衡，改善心功能，治療心力衰竭。經(jīng)四君子湯治療后，模型大鼠心功能較正常情況下雖仍存在一定差距，但也提示腸道菌群可能為治療心力衰竭的靶點(diǎn)。

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Mechanism Study ofDecoction on Rats with Heart Failure Through Regulating the Imbalance of Intestinal Flora

LU Yongkang1, CHEN Tiaoyuan2, ZHUANG Xianmian1, LI Jian2, JIANG Xiaoyan2, XU Sisi2, HUANG Yanzi2, HUANG Bin2

To explore the mechanism ofDecoction on rat model with heart failure from the perspective of regulating intestinal flora.Totally 40male Wistar rats were divided into sham group, model group,Decoction group and probiotics group. Heart failure model was prepared by myocardial infarction induced by ligation of left anterior descending coronary artery, and myocardial infarction was confirmed by ECG, myocardium TTC and HE staining. Colon HE staining was performed for evaluation of intestinal mucosa structure under heart failure. Echocardiography was performed to evaluate cardiac function before and after treatment. The bacterial 16S rRNA sequencing was executed to detect intestinal flora.Myocardium HE staining showed that amount of cardiomyocytes of model group was less than that of the sham group, cell morphologic changes was atrophied, and myofiber was loose. Colon HE staining showed that damaged intestinal mucosal structure of the model group, disordered cell arrangement, atrophied and adhesive villi, irregularly arranged and reduced intestinal crypts, as well as the normal structure of the glands disappeared and becamed vacuolated. Echocardiography showed that myocardium of model group was significantly thinner than that of sham group before treatment, and heart chambers were enlarged, LVEDd and LVESd significantly increased, LVEF was significantly reduced (<0.001); after treatment, compared with model group, LVEDd and LVESd were markedly reduced (<0.001), as well as LVEF was markedly increased (<0.001) inDecoction group. The sequencing results showed that compared with sham group, imbalance of intestinal flora was observed in model group: at the phylum level, the abundance of Firmicutes was significantly reduced (<0.001), while the abundance of Bacteroidetes and Verrucomicrobia were significantly increased (<0.001,<0.05); at the genus level, the abundance ofandwas significantly reduced (<0.001,<0.05), while the abundance ofandsignificantly increased (<0.001,<0.05). Compared with model group, imbalance of intestinal flora inDecoction group was obviously improved: at the phylum level, the abundance of Firmicutes increased and the abundance of Bacteroidetes decreased, both with statistical significance (<0.05); at the genus level, the abundance ofandincreased, and the abundance ofdecreased, all with statistical significance (<0.05).Decoction can play a certain therapeutic effect on rat model with heart failure after myocardial infarction by regulating the imbalance of intestinal flora.

heart failure; intestinal flora;Decoction; Chinese herb; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)04-0081-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202008395

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（JCYJ20170307155824718）

黃彬，E-mail：677825889@qq.com

（收稿日期：2020-08-25）

（修回日期：2020-09-18；編輯：華強(qiáng)）