張旭輝，劉喜平，孫杰，武妍琳，陳嘉慧，崔國寧

實驗研究

升陷湯對肺纖維化大鼠肺組織α-平滑肌肌動蛋白、肺表面活性蛋白D及TGF-β1/Smads通路蛋白表達的影響

張旭輝1，劉喜平1，2，孫杰3，武妍琳1，陳嘉慧2，崔國寧2

1.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000； 3.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

觀察升陷湯對肺纖維化大鼠肺組織α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、肺表面活性蛋白D（SP-D）及TGF-β1/Smads通路蛋白表達的影響，探討其作用機制。SPF級SD雄性大鼠60只，隨機分為正常組、模型組、吡非尼酮組和升陷湯高、中、低劑量組。除正常組外，其余大鼠采用氣管內(nèi)注射硫酸博萊霉素建立肺纖維化模型，造模后第8日起，升陷湯高、中、低劑量組分別予10.4、5.2、2.6 g/（kg?d）升陷湯灌胃，吡非尼酮組予0.72 g/（kg?d）吡非尼酮混懸液灌胃，連續(xù)28 d。記錄大鼠肺臟質(zhì)量和體質(zhì)量，計算肺臟系數(shù)，HE染色觀察大鼠肺組織病理變化，Masson染色觀察大鼠肺組織纖維化程度，免疫組化檢測大鼠肺組織α-SMA、SP-D的表達，Western blot檢測大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、Smad2、Smad7蛋白的表達。與正常組比較，模型組大鼠肺臟質(zhì)量和肺臟系數(shù)明顯增加，體質(zhì)量明顯減輕，肺組織損傷評分和肺組織膠原容積分數(shù)明顯增加（＜0.05），肺組織α-SMA、TGF-β1、Smad2蛋白表達明顯升高，SP-D、Smad7蛋白表達明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，升陷湯高、中、低劑量組大鼠肺臟質(zhì)量和肺臟系數(shù)明顯降低，體質(zhì)量增加，肺組織損傷評分及肺組織膠原容積分數(shù)明顯降低（＜0.05），肺組織α-SMA、TGF-β1、Smad2蛋白表達明顯降低，SP-D、Smad7蛋白表達明顯升高（＜0.05）。升陷湯可降低肺纖維化模型大鼠肺臟質(zhì)量，增加大鼠體質(zhì)量，降低肺組織損傷，其機制可能與下調(diào)肺組織α-SMA、TGF-β1、Smad2蛋白的表達，上調(diào)SP-D、Smad7蛋白的表達相關。

升陷湯；肺纖維化；α-平滑肌肌動蛋白；肺表面活性蛋白D；TGF-β1/Smads通路；大鼠

肺纖維化是多種彌漫性間質(zhì)性肺疾病的共同病理改變和最終結(jié)局。肺功能減弱、肺組織肌成纖維細胞激活、細胞外基質(zhì)（ECM）過度形成和膠原持久沉積是其主要特點[1]。肺纖維化發(fā)病機制尚未明確，目前缺乏有效治療手段，預后較差。臨床多用糖皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑等藥物治療，但效果并不顯著，新藥吡非尼酮、尼達尼布雖有一定療效，但價格昂貴，不良反應明顯，臨床應用受限。中醫(yī)對肺纖維化的防治進行了許多有益的探索，并在改善患者肺功能、延緩肺纖維化進程、降低病死率方面具有明顯優(yōu)勢。有學者對肺纖維化中醫(yī)證候要素演變規(guī)律研究表明，氣虛是其核心證候要素，貫穿于肺纖維化發(fā)病的不同臨床分期[2]。研究發(fā)現(xiàn)，由氣虛引起的胸中“大氣下陷”在肺纖維化發(fā)病中具有重要意義，益氣升陷法是肺纖維化的關鍵治法[3]。升陷湯源于《醫(yī)學衷中參西錄》，具有益氣升陷之功，是治療胸中“大氣下陷”代表方劑[4]，臨床治療肺纖維化療效肯定[5]，但機制尚不明確。α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是肌成纖維細胞活化的重要指標之一[6]。肺表面活性蛋白D（pulmonary surfactant protein D，SP-D）是肺泡上皮細胞分泌的一種親水性脂蛋白，可維持肺泡腔內(nèi)肺表面活性物質(zhì)磷脂的正常結(jié)構和功能[7]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是迄今最為明確的ECM誘導劑，TGF-β1與TGF-βⅡ型受體（TGF-βRⅡ）結(jié)合，活化后的TGF-βRⅡ使Ⅰ型受體的絲甘氨酸序列結(jié)構域磷酸化，并與Ⅰ型受體形成異源聚體復合物，激活下游的Smads信號通路，Smads家族中的Smad2是TGF-β1/Smads通路中的主要活化蛋白，與肺纖維化的形成密切相關；Smad7則具有抑制TGF-β1/Smads通路活化的作用[8]。本研究采用硫酸博萊霉素誘導建立肺纖維化大鼠模型，觀察升陷湯對肺纖維化大鼠肺組織α-SMA、SP-D及TGF-β1/Smads蛋白表達的影響，揭示升陷湯延緩肺纖維化大鼠肺組織纖維化的效應機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，6～8周齡，甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號SCXK（甘）2011-0002-0002141。常規(guī)飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級動物房，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，12 h光暗循環(huán)。本研究所有動物實驗經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查批準（2019-205）。

1.2 藥物及制備

升陷湯（黃芪、知母、柴胡、桔梗、升麻），飲片由甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學藥學院景明教授鑒定符合2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。上述飲片按《醫(yī)學衷中參西錄》升陷湯原方比例[4]，即黃芪、知母、柴胡、桔梗、升麻按36∶18∶5∶5∶6比例混合，水煎煮2次，每次30 min，粗濾去除藥渣，合并2次濾液，濃縮為含原藥材1.26 g/mL；吡非尼酮膠囊，北京康蒂尼藥業(yè)有限公司，批號190923，100 mg/粒，配制成0.036 g/mL混懸液備用。硫酸博萊霉素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號B107423。

1.3 主要試劑與儀器

α-SMA一抗，英國Abcam公司，批號AB6776；SP-D一抗，英國Abcam公司，批號134047；山羊抗鼠IgG二抗，美國Sigma公司，批號AB6743；山羊抗兔IgG二抗，美國Sigma公司，批號AB6939；HRP標記二抗，上海碧云天生物技術有限公司，批號A0208；多聚甲醛，上海生工生物工程技術服務有限公司，批號PB0684-500g；水合氯醛，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號302170；蘇木素染液，南京建成生物科技有限公司，批號D006；伊紅染液，上海碧云天生物技術有限公司，批號C0109；蘇木素，南京建成生物科技有限公司，批號D005。GAPDH，英國Abcam公司，貨號ab124012；TGF-β1一抗，英國Abcam公司，貨號ab143065；Smad2一抗，美國CST公司，貨號CST3102；Smad7一抗，英國Abcam公司，貨號ab169492。XB220A型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；CKX41倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；HI1220型烤片機，德國Leica公司；RM2255型切片機，德國Leica公司；Nano Zoomer-SQ型數(shù)字切片掃描儀，日本濱松光子學株式會社；垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置，美國Bio-Rad；Tanon 2500R凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；穩(wěn)壓DNA電泳儀，美國Tianneng公司。

2 實驗方法

2.1 分組及造模

大鼠適應性喂養(yǎng)1周，按隨機數(shù)字表法選擇10只為正常組，不進行任何干預，其余大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，氣管內(nèi)注射硫酸博萊霉素5 mg/kg建立肺纖維化模型[9]。造模完成后將大鼠再隨機分為模型組、吡非尼酮組和升陷湯高、中、低劑量組，每組10只。給藥劑量參照人與大鼠體表系數(shù)折算[10]，造模成功后第8日開始，升陷湯高、中、低劑量組分別給予10.4、5.2、2.6 g/kg升陷湯灌胃（相當于臨床成人劑量12、6、3倍），吡非尼酮組給予吡非尼酮混懸液0.72 g/kg灌胃（相當于臨床成人劑量6倍）。給藥體積10 mL/kg，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)28 d。

2.2 肺臟質(zhì)量、體質(zhì)量及肺臟系數(shù)測定

大鼠腹腔注射7%水合氯醛（0.05 mL/kg）麻醉，固定于解剖臺，逐層分離各層組織，迅速摘取肺臟，并用預冷的生理鹽水清洗，棄肺外氣管后稱重，參考文獻[11]方法計算肺臟系數(shù)。肺臟系數(shù)（%）＝肺臟質(zhì)量（g）÷體質(zhì)量（g）×100%。

2.3 肺組織病理觀察

取右下葉肺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（厚約5 μm），脫蠟復水，蘇木素染液染色10 min，再用伊紅染液染色30 s，蒸餾水洗滌，95%乙醇脫水2 min，二甲苯透明5 min，中性樹脂封片。鏡下觀察肺組織損傷情況，每張切片選擇3個視野拍照，進行肺組織炎癥病理程度評分[12]。0分：肺組織結(jié)構正常，無炎性細胞浸潤，結(jié)構清晰；1分：肺組織結(jié)構正常，可見輕微炎性細胞浸潤，有輕微組織變性、壞死；2分：肺組織結(jié)構明顯改變，可見較多炎性細胞浸潤，組織變性、壞死；3分：肺組織結(jié)構顯著異常，可見炎性浸潤，組織變性、壞死，肺組織結(jié)構模糊。同時，石蠟包埋切片，行Masson染色，鏡下觀察肺組織纖維化改變，通過Image J軟件計算膠原容積分數(shù)（collagen volume fraction，CVF），即藍色面積占組織總面積的百分比。

2.4 免疫組化檢測肺組織α-平滑肌肌動蛋白和肺表面活性蛋白D的表達

將肺組織切片常規(guī)脫蠟，抗原修復后滴加正常山羊血清封閉液，室溫放置20 min，分別滴加α-SMA、SP-D一抗50 μL（1∶200），37 ℃放置60 min，再加入HRP標記二抗（1∶70），37 ℃放置30 min。按試劑盒說明書進行DAB顯色10 min，蘇木素復染5 min，脫水，透明，封片。用數(shù)字切片掃描儀對切片進行拍照，觀察染色結(jié)果，細胞質(zhì)和/或細胞核中見棕黃色或棕褐色顆粒即為α-SMA及SP-D染色陽性。采用Image Pro Plus 6.0進行分析，每個樣本隨機選取6個視野，測量每個視野陽性染色面積（μm2），計算陽性染色面積與總面積的比值。

2.5 Western blot檢測肺組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1、Smad2、Smad7蛋白的表達

提取肺組織總蛋白，按BCA法檢測總蛋白濃度后，將蛋白與5×SDS上樣緩沖液按4∶1混合，沸水煮5 min，使蛋白變性。加入電泳液后等量蛋白上樣，電泳，80 V電泳30 min，120 V電泳2 h，200 mA、4 ℃濕轉(zhuǎn)2 h；5%脫脂牛奶（TBST配制）室溫封閉2 h，按1∶1000稀釋TGF-β1、Smad2、Smad7和GAPDH抗體，溫育1.5 h；次日按1∶1000稀釋二抗，溫育1.5 h；TBST清洗4次，每次5 min。凝膠成像儀測量條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白相對表達量。

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

4.1 升陷湯對大鼠肺臟質(zhì)量、體質(zhì)量及肺臟系數(shù)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺臟質(zhì)量、肺臟系數(shù)明顯增加，體質(zhì)量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01，＜0.05）；與模型組比較，升陷湯各劑量組和吡非尼酮組大鼠肺臟質(zhì)量、肺臟系數(shù)均顯著降低，體質(zhì)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05，＜0.01）。見表1。

4.2 升陷湯對肺纖維化大鼠肺組織病理形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肺組織結(jié)構及肺泡壁均完整，細支氣管壁及肺泡隔少見炎性細胞浸潤；模型組大鼠肺組織結(jié)構破壞嚴重，肺間質(zhì)纖維組織廣泛增生，纖維化區(qū)可見大量膠原纖維沉積及增生纖維細胞，并見大小不等囊性纖維氣腔，肺泡腔內(nèi)可見大量炎性細胞浸潤；升陷湯各劑量組和吡非尼酮組大鼠炎性細胞浸潤明顯減輕，成纖維細胞及膠原纖維沉積明顯減少，肺組織炎癥評分顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05，＜0.01）。Masson染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肺泡區(qū)可見少量膠原纖維，支氣管壁膠原層較??；模型組各區(qū)域均可見大量膠原纖維增生，彌漫性肺纖維化形成；升陷湯各劑量組和吡非尼酮組膠原纖維明顯減少，CVF顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05，＜0.01）。見圖1、圖2和表2。

表1 各組大鼠肺臟質(zhì)量、體質(zhì)量及肺臟系數(shù)比較（±s）

注：與正常組比較，*＜0.05，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)（HE染色，×400）

圖2 各組大鼠肺組織形態(tài)（Masson染色，×400）

表2 各組大鼠肺組織炎癥評分和CVF比較（±s）

注：與正常組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

4.3 升陷湯對大鼠肺組織α-平滑肌肌動蛋白和肺表面活性蛋白D表達的影響

免疫組化染色顯示，正常組大鼠肺組織可見少量α-SMA蛋白表達，大量SP-D蛋白表達；與正常組比較，模型組大鼠肺組織α-SMA蛋白表達顯著升高，SP-D蛋白表達顯著降低（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，升陷湯各劑量組大鼠肺組織α-SMA蛋白表達顯著降低，SP-D蛋白表達顯著升高（＜0.05，＜0.01）。見圖3、圖4和表3。

圖3 各組大鼠肺組織α-SMA蛋白陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖4 各組大鼠肺組織SP-D蛋白陽性表達（免疫組化染色，×400）

表3 各組大鼠肺組織α-SMA、SP-D蛋白表達比較（±s，%）

注：與正常組比較，*＜0.05，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

4.4 升陷湯對大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1、Smad2、Smad7蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2蛋白表達顯著升高（＜0.01），Smad7蛋白表達顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，升陷湯各劑量組和吡非尼酮組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2蛋白表達顯著降低（＜0.05，＜0.01），Smad7蛋白表達顯著升高（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見圖5、表4。

注：A.正常組；B.模型組；C.升陷湯高劑量組；D.升陷湯中劑量組；E.升陷湯低劑量組；F.吡非尼酮組

表4 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

5 討論

肺纖維化屬中醫(yī)學“肺痿”范疇，其臨床證候錯綜復雜。肺纖維化患者臨床常見呼吸淺短而不相順接，隨著肺纖維化病情發(fā)展，部分患者常出現(xiàn)心悸、氣短、面色灰黯、紫紺及舌質(zhì)瘀斑青紫等瘀血阻滯、肺絡不通的表現(xiàn)。升陷湯由黃芪、知母、柴胡、桔梗、升麻組成，方中重用黃芪為君藥，補大氣，舉下陷，又能通過補氣令氣旺血行、瘀去絡通；柴胡、升麻升陽舉陷，助黃芪升舉大氣下陷，共為臣藥；佐以涼潤之知母，以制黃芪之溫燥；桔梗入胸中肺經(jīng)，性善上行，既開宣肺氣，又載藥上行，直達病所，為使藥。全方藥少力專，共奏益氣升陷之功，與肺纖維化“大氣下陷”證候相對應。

肺成纖維細胞是肺纖維化發(fā)生發(fā)展的重要效應細胞[13]，肺成纖維細胞轉(zhuǎn)化為大量肌成纖維細胞參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，是肺纖維化的主要原因。α-SMA是肌成纖維細胞活化的指標。SP-D具有降低肺泡表面張力，維持肺泡腔內(nèi)肺表面活性物質(zhì)磷脂正常結(jié)構和功能，提高肺的順應性、促進肺氣體交換及阻滯肺泡炎性水腫等作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化患者肺組織SP-D表達明顯下降，且肺組織中SP-D表達越低，纖維化程度越嚴重，生存率越低，預后越差[14]。因此，α-SMA和SP-D表達水平可作為肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化及判斷肺纖維化程度的重要標志[15]。進一步研究表明，肺成纖維細胞中α-SMA的表達受TGF-β的調(diào)控[16]。TGF-β1是影響肺纖維化發(fā)生發(fā)展的致纖維化因子，能刺激纖維粘連蛋白和膠原蛋白等ECM合成和過度沉積[17]，誘發(fā)成纖維細胞過度增殖和分化，產(chǎn)生大量肌成纖維細胞[18]。Smad蛋白是TGF-β1誘導纖維化作用的關鍵效應分子，TGF-β1與其受體結(jié)合后，可產(chǎn)生磷酸化Smad2，磷酸化Smad2轉(zhuǎn)移到核內(nèi)可啟動TGF-β1靶基因的轉(zhuǎn)錄[19]。Smad7是Smads家族的抑制性分子，可與Smad2等激活性Smads家族分子競爭TGF-β1受體，阻斷TGF-β信號傳遞[20]。因此，調(diào)控TGF-β1/Smad通路相關分子的表達是治療肺纖維化的重要途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化大鼠肺組織可見肺泡結(jié)構不同程度破壞，肺間質(zhì)增生，炎性細胞浸潤和膠原纖維增生明顯；肺組織α-SMA蛋白表達顯著升高，SP-D蛋白表達顯著降低，二者存在明顯負相關。同時，肺組織TGF-β1、Smad2蛋白表達顯著升高，Smad7蛋白表達顯著降低。升陷湯可通過降低肺纖維化大鼠肺組織α-SMA、TGF-β1、Smad2蛋白的表達，提高SP-D、Smad7蛋白的表達，減輕肺纖維化大鼠肺組織炎性細胞浸潤程度，減少膠原纖維沉積，抑制纖維增生，發(fā)揮抗肺纖維化的作用。

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Effects ofDecoction on Expressions of α-Smooth Muscle Actin, Pulmonary Surfactant Protein D and TGF-β1/Smads Pathway in Lung Tissue of Rats with Pulmonary Fibrosis

ZHANG Xuhui1, LIU Xiping1,2, SUN Jie3, WU Yanlin1, CHEN Jiahui2, CUI Guoning2

To observe the effects ofDecoction on expressions of α-smooth muscle actin (α-SMA), pulmonary surfactant protein D (SP-D) and TGF-β1/Smads pathway in lung tissue of model rats with pulmonary fibrosis; To explore its mechanism of action.Totally sixty male SD rats with SPF grade were randomly divided into normal group, model group,Decoction high-, medium- and low-dosage groups and pirafenidone group. Except for the normal group, the remaining rats were injected with bleomycin to establish the pulmonary fibrosis model. From the 8th day after the model was established, the high, medium and low dosages of 10.4, 5.2, 2.6 g/(kg?d)Decoction were respectively given for gavage. The rats in the pirafenidone group received 0.72 g/(kg?d) pirafenidone suspension. After 28 days, the lung mass and body mass of the rats were recorded and the lung coefficient was calculated. HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissues in each group. Masson staining was used to observe the degree of pulmonary fibrosis in each group. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of α-SMA and SP-D in lung tissue. The expressions of TGF-β1, Smad2 and Smad7 were detected by Western blot.Compared with the normal group, the lung mass and lung coefficient of the model group significantly increased, the body mass was reduced, the lung injury score and lung collagen volume fraction increased (<0.05), the expressions of α-SMA, TGF-β1 and Smad2 protein in lung tissue increased, and the expressions of SP-D and Smad7 protein decreased (<0.05). Compared with the model group, lung mass and lung coefficient were reduced, body mass increased, lung injury score and lung tissue collagen volume fraction decreased (<0.05), the expressions of α-SMA, TGF-β1 and Smad2 in lung tissues decreased, while the expressions of SP-D and Smad7 increased inDecoction high-, medium- and low-dosage groups (<0.05).Decoction can reduce the lung mass of model rats, increase the body mass of rats, and reduce lung tissue damage, and the mechanism may be related to down-regulation of expressions of α-SMA and TGF-β1, Smad2 protein, and up-regulation of expressions of SP-D and Smad7 protein.

Decoction; pulmonary fibrosis; α-SMA; SP-D; TGF-β1/Smads pathway; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)04-0063-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202007587

甘肅省自然科學基金（20JR5RA165）；甘肅中醫(yī)藥大學科研發(fā)展基金（81360539）

劉喜平，E-mail：lxpd-257@163.com

（收稿日期：2020-07-29）

（修回日期：2020-09-07；編輯：華強）