董 晗，王智昊，王 哲，高 飛，王越暉

癲癇(epilepsy)是神經(jīng)系統(tǒng)的慢性疾病之一，發(fā)作具有反復(fù)性、不可預(yù)測(cè)性等特點(diǎn)。癲癇的反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致患者認(rèn)知功能障礙與生活質(zhì)量下降，且增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。癲癇的年發(fā)病率約為61.4/10萬人，預(yù)計(jì)全球受累患者約5000～8000萬[1]。采用抗癲癇藥物、手術(shù)等治療手段，仍有相當(dāng)比例的患者病情得不到有效控制。此外，大部分抗癲癇藥物長期服用會(huì)出現(xiàn)一定的毒副作用，導(dǎo)致患者依從性降低[2，3]。Apelin(APLN)是一種生物活性肽，為孤兒G蛋白偶聯(lián)受體(APJ)的內(nèi)源性配體，在血壓調(diào)節(jié)、攝食行為、垂體激素釋放及神經(jīng)元損傷保護(hù)中均發(fā)揮重要作用[4]。APLN可通過抑制炎癥反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激、降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度、抗凋亡等途徑對(duì)神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用[5～8]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)APLN對(duì)癲癇神經(jīng)元損傷具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制涉及到調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)、抑制代謝型谷氨酸受體1(metabotropic glutamate receptor 1，mGluR1)表達(dá)等[9]。然而，APLN在癲癇中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制目前仍不清楚，現(xiàn)將我們的研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 神經(jīng)元培養(yǎng)基及神經(jīng)生長因子購至美國Sciencell公司，miR-124、U6、APLN等引物購至吉林庫美生物有限公司，TRIzol購至美國Invitrogen公司，SYBR Green Mix實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、ReverTra Ace qPCR購至TOYOBO 公司，雙熒光素酶報(bào)告基因載體pmiR-RB REPORT購至銳博生物，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購至Promega 公司，胎牛血清、Opti MEM無血清培養(yǎng)基、流式凋亡檢測(cè)試劑盒分別購至GBICO公司、Tuoran公司與凱奇生物，APLN抗體、Bax抗體、caspase 3抗體、Bcl-2抗體及β-actin抗體購至Abcam公司。

1.2 癲癇神經(jīng)元模型構(gòu)建 大鼠海馬神經(jīng)元購自上?？道噬锟萍加邢薰尽２捎霉P者前期研究方案低鎂細(xì)胞外液培養(yǎng)建立癲癇神經(jīng)元模型[9]。大鼠海馬神經(jīng)元在維持液培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d后，棄掉原培養(yǎng)基，用低鎂細(xì)胞外液培養(yǎng)3 h后用PBS溶液洗兩次，后繼續(xù)轉(zhuǎn)入維持液培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。正常細(xì)胞外液組成成分：NaCl 145 mmol/L，KC1 2.5 mmol/L，CaCl22 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，MgC121 mmol/L，甘氨酸0.002 mmol/L；用5 mmol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.3，調(diào)整滲透壓在280～320 mmol/L。低鎂細(xì)胞外液組成成分：NaCl 145 mmol/L，KCl 2.5 mmol/L，CaCl22 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，甘氨酸0.002 mmol/L，用5 mmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH 至7.3，調(diào)整滲透壓在280 ～ 320 mmol/L。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)于6孔板，24 h后細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。采用FuGene HD轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作步驟參照說明書。培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清(150 μl)、不同類型載體(4 μg)與FuGene HD轉(zhuǎn)染試劑(7.5 μl)，室溫孵育15 min。轉(zhuǎn)染24 h后更換培養(yǎng)基，并去除死亡細(xì)胞。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 收集各組細(xì)胞于流式管中，每管細(xì)胞數(shù)2～5×105，用PBS洗2次，Annexin V染色30分，4 ℃避光。后用PBS洗2次。上機(jī)前加入5 μl稀釋PI液后，充分混勻，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 qRT-PCR檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，采用Trizol提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用mRNA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)mRNA表達(dá)，GAPDH設(shè)為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 蛋白印跡(western blotting)檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，加入裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，上樣、電泳，最后經(jīng)轉(zhuǎn)膜、顯色等確定各組蛋白表達(dá)水平。檢測(cè)抗體包括Bax、Bcl-2、Caspase-3、APLN抗體，β-actin設(shè)置為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 雙熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè) 將海馬神經(jīng)元培養(yǎng)于24孔板。神經(jīng)元培養(yǎng)24 h后采用Lipofectamine 2000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將miR-124 mimics、miR-124 mimics對(duì)照與APLN基因野生型、突變型載體共同轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用雙熒光素報(bào)告酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 miR-124與APLN靶標(biāo)關(guān)系的研究 通過多個(gè)生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)(Target Scan、NCBI、miRbase等)，結(jié)果提示APLN基因表達(dá)可能受miR-124調(diào)控。因此，我們采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證miR-124與APLN的靶標(biāo)關(guān)系，將miR-124 mimics分別與APLN基因野生型、突變型、空載體3種報(bào)告基因載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果見圖1。miR-124+APLN野生型組的熒光素酶活性低于miR-124+APLN突變型組和miR-124+空載體組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-124+空載體組與miR-124+APLN突變型組熒光素酶活性無明顯差異。

圖1 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-124與APLN的靶標(biāo)關(guān)系

2.2 miR-124對(duì)神經(jīng)元APLN表達(dá)的影響 將miR-124 mimics、miR-124 inhibitor與對(duì)照miRNA轉(zhuǎn)染神經(jīng)元，通過qRT-PCR檢測(cè)miR-124、APLN mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-124 mimics組miR-124的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，而miR-124 inhibitor組miR-124的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(見圖2A)，提示成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)神經(jīng)元miR-124的表達(dá)調(diào)控。與對(duì)照組相比，miR-124 mimics組APLN mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，而miR-124 inhibitor組APLN mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(圖2B)。

圖2 調(diào)控miR-124表達(dá)對(duì)miR-124與APLN基因mRNA表達(dá)的影響。A：miR-124 mRNA相對(duì)表達(dá)水平；B：APLN mRNA相對(duì)表達(dá)水平

采用western blotting對(duì)神經(jīng)元APLN蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，miR-124 mimics組與miR-124 inhibitor組APLN表達(dá)量明顯升高，且miR-124 mimics組高于miR-124 inhibitor組(見圖3A、3B)。

圖3 調(diào)控miR-124表達(dá)對(duì)APLN蛋白表達(dá)的影響。A：不同組western blotting檢測(cè)代表性結(jié)果圖；B：不同組western blotting檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖

2.3 miR-124對(duì)癲癇神經(jīng)元凋亡的影響 海馬神經(jīng)元癲癇模型轉(zhuǎn)染miR-124 mimics、miR-124 inhibitor與對(duì)照miRNA后，經(jīng)流式細(xì)胞儀Annexin V/PI染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況，結(jié)果見圖4。與對(duì)照組相比，miR-124 mimics組神經(jīng)元凋亡率明顯升高，而miR-124 inhibitor轉(zhuǎn)染對(duì)神經(jīng)元凋亡無明顯影響(見圖4A、4B)。

圖4 miR-124對(duì)癲癇神經(jīng)元凋亡的影響。A：不同組流式細(xì)胞儀檢測(cè)神經(jīng)元凋亡代表性結(jié)果圖；B：不同組神經(jīng)元凋亡的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 miR-124對(duì)癲癇神經(jīng)元凋亡蛋白表達(dá)的影響 海馬神經(jīng)元癲癇模型轉(zhuǎn)染miR-124 mimics、miR-124 inhibitor、對(duì)照miRNA，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。經(jīng)western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase 3與Bcl-2的表達(dá)情況，結(jié)果見圖5。與對(duì)照組相比，miR-124 mimics組神經(jīng)元Bax(見圖5A、5B)、Caspase 3(見圖5A、5C)表達(dá)水平明顯升高，而Bcl-2(見圖5A、5D)的表達(dá)水平顯著降低。miR-124 inhibitor轉(zhuǎn)染后神經(jīng)元caspase 3(見圖5A、5C)表達(dá)水平顯著降低，而對(duì)Bax與Bcl-2表達(dá)無影響(見圖5A、5B、5D)。

圖5 miR-124對(duì)癲癇神經(jīng)元凋亡蛋白表達(dá)的影響。A：不同組western blotting代表性結(jié)果圖；B：不同組神經(jīng)元Bax蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；C：不同組神經(jīng)元caspase 3蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；D：不同組神經(jīng)元Bcl-2蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖

3 討 論

神經(jīng)元損傷在癲癇等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程中均發(fā)揮十分重要的作用[10]。盡管癲癇小發(fā)作不一定會(huì)引起神經(jīng)元損傷，但嚴(yán)重癲癇或癲癇的反復(fù)發(fā)作無疑會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[11]。盡管神經(jīng)元損傷與癲癇反復(fù)發(fā)作的因果關(guān)系目前尚存在一定的爭議，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明癲癇導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元損傷可引起癲癇發(fā)作頻率增加與嚴(yán)重癲癇的發(fā)作[12]。興奮性毒性是癲癇相關(guān)神經(jīng)元損傷的重要機(jī)制。過度激活的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)可導(dǎo)致大量鈣離子內(nèi)流，繼而激活多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[13]。mGluR1在興奮毒性誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中發(fā)揮十分重要的作用[14]。筆者前期研究結(jié)果證實(shí)APLN可抑制癲癇導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡，上調(diào)抗凋亡蛋白表達(dá)，下調(diào)凋亡蛋白表達(dá)，并首次發(fā)現(xiàn)APLN可下調(diào)mGluR1表達(dá)[9]。因此，APLN可能是癲癇預(yù)防或治療的潛在干預(yù)靶點(diǎn)。然而，深入研究APLN在癲癇神經(jīng)元損傷中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有重要的臨床意義。

作為神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)保守表達(dá)的微小RNA，miR-124在脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均發(fā)揮十分重要的作用[15]。miR-124在癲癇病理機(jī)制中的作用目前尚存爭議。一方面miR-124可能通過抑制神經(jīng)元興奮性、延長癲癇發(fā)作潛伏期等抑制癲癇的發(fā)作，另一方面miR-124可通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞與炎癥反應(yīng)等促進(jìn)癲癇的發(fā)作[16]。通過多種生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-124可能調(diào)控APLN表達(dá)。因此，在本研究中我們首先通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析miR-124對(duì)APLN表達(dá)的調(diào)控作用。結(jié)果提示miR-124+APLN基因野生型組熒光素酶活性低于對(duì)照組，盡管尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，提示miR-124可能與APLN直接結(jié)合。此后我們研究了miR-124對(duì)APLN表達(dá)的影響，結(jié)果顯示上調(diào)miR-124表達(dá)可明顯上調(diào)APLN mRNA與蛋白的表達(dá)，下調(diào)miR-124表達(dá)可下調(diào)APLN mRNA表達(dá)，但APLN蛋白表達(dá)無明顯降低。盡管微小RNA負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)是其發(fā)揮生物學(xué)功能的主要途徑，但有證據(jù)提示微小RNA可正調(diào)控靶基因表達(dá)[17，18]。因此，上述研究結(jié)果提示miR-124可能正調(diào)控APLN基因的表達(dá)。

有研究表明miR-124具有神經(jīng)保護(hù)作用，可抑制神經(jīng)元凋亡[19，20]，但亦有研究報(bào)道在缺血性腦損傷中，下調(diào)miR-124表達(dá)可減少神經(jīng)元凋亡、縮小腦梗死病灶[21]。采用流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-124表達(dá)可促進(jìn)癲癇海馬神經(jīng)元凋亡，而下調(diào)miR-124表達(dá)對(duì)神經(jīng)元凋亡無明顯影響。機(jī)制研究也發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-124表達(dá)可上調(diào)促凋亡蛋白Bax、caspase 3表達(dá)、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)。盡管miR-124可能正調(diào)控APLN表達(dá)，但miR-124上調(diào)并未顯示出神經(jīng)保護(hù)作用，相反卻促進(jìn)癲癇神經(jīng)元凋亡。因此，miR-124可能通過其他機(jī)制促進(jìn)神經(jīng)元凋亡。

綜上，本研究結(jié)果提示miR-124與APLN基因可能存在靶標(biāo)關(guān)系，miR-124可能正調(diào)控APLN表達(dá)。miR-124除可調(diào)控APLN表達(dá)外，還可能調(diào)控其他基因表達(dá)，最終表現(xiàn)為促進(jìn)癲癇海馬神經(jīng)元凋亡。因此，本研究揭示了癲癇神經(jīng)元損傷中APLN表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性，其更為精準(zhǔn)的表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍有待更多研究探索。