李 娜，張 磊，王建楠，李 靜，喬嘉璐，王奕丹，隋汝波

腦缺血性卒中，是指各種原因所致腦部血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致局部腦組織缺血、缺氧性壞死，而出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能缺損的一類臨床綜合征[1]。其已成為我國居民死亡的首要原因[2]。目前治療手段中，不論是急性期的靜脈溶栓、機(jī)械取栓，還是后續(xù)的抗栓、他汀類藥物降脂穩(wěn)定斑塊治療，仍有26%～43%的患者病情進(jìn)展加重[3]，目前考慮可能與水腫、持續(xù)低灌注及缺血再灌注損傷等相關(guān)。靜脈溶栓及機(jī)械取栓雖然在治療上可直接疏通阻塞血管，實(shí)現(xiàn)血管再通，但此種治療方法的關(guān)鍵問題——治療時間窗很大程度上限制了治療的進(jìn)行，同時，腦缺血再灌注損傷亦不容忽視[4]，而目前臨床應(yīng)用清除氧自由基、神經(jīng)保護(hù)劑等治療效果欠佳，積極控制血壓可能有效，但目前具體控制范圍尚不明確[5]。所以深入探討有效治療手段勢在必行。

芬戈莫德(FTY720)為一種新型口服免疫抑制劑，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的作用機(jī)制有FTY720對神經(jīng)細(xì)胞的直接保護(hù)作用、促進(jìn)微血管形成、減少淋巴細(xì)胞從淋巴結(jié)的流出及促進(jìn)淋巴細(xì)胞歸巢、阻止病灶處小膠質(zhì)細(xì)胞激活、通過mTOR/p70S6K通路降低神經(jīng)元自噬、減少帕金森病相關(guān)蛋白及多巴胺能神經(jīng)元丟失等諸多方面。目前FTY720已被批準(zhǔn)用于治療多發(fā)硬化[6]。有研究報道FTY720對大鼠腦出血繼發(fā)神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用[7]；在大鼠自閉癥模型中，F(xiàn)TY720可改善大鼠空間障礙、學(xué)習(xí)障礙[8]，說明其具有神經(jīng)保護(hù)作用；近年研究指出FTY720亦可減輕急性缺血性卒中損傷模型動物的癥狀。其機(jī)制可能與外周淋巴細(xì)胞遷徙及中樞膠質(zhì)細(xì)胞活化進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)相關(guān)。基于目前研究表明的缺血性卒中存在炎癥反應(yīng)機(jī)制，F(xiàn)TY720或可作為一種新藥物應(yīng)用于腦血管疾病。

炎癥因子升高機(jī)制研究表明p38MAPK(mitogen-activated protein kinase，MAPK)磷酸化可能與此過程相關(guān)[9，10]。p38MAPK在下游可與NF-κB通路聚集，調(diào)控其炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和作用[11，12]。p38MAPK通路在缺血損傷腦組織中顯著升高，有報道提到結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈致缺血7 min后再灌注，發(fā)現(xiàn)大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)p38MAPK活性增強(qiáng)，并且p38MAPK抑制劑可有效減少神經(jīng)元死亡[13]，其機(jī)制可能與直接降低下游炎癥反應(yīng)相關(guān)以及與小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)(見圖1)。由此我們想探討FTY720能否改善局灶性缺血再灌注模型神經(jīng)缺損癥狀及減輕神經(jīng)元損傷，而這一保護(hù)作用是否與p38MAPK通路和炎癥因子相關(guān)。

圖1 腦缺血性卒中后免疫反應(yīng)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 8 w齡(250～300 g)SD大鼠雌雄各半。錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，飼養(yǎng)于錦州醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 主要試劑 硫酸氫氯吡格雷片(賽諾菲)；芬戈莫德(Sigma公司)；TTC染料(南京生物建成有限公司)、組織蛋白提取試劑盒(Bestbio)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(Bestbio)；IL-1βELISA試劑盒(云克隆生物技術(shù)有限公司)、IL-6 ELISA試劑盒(云克隆生物技術(shù)有限公司)。p-p38MAPK抗體(Afinity Biosciences)、NF-κB抗體(Afinity Biosciences)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及給藥 實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、空白對照組、氯吡格雷組及FTY720組；氯吡格雷組給予硫酸氫氯吡格雷7.71 mg/(kg·d)1次灌胃，F(xiàn)TY720組給予硫酸氫氯吡格雷7.71 mg/kg+FTY720 0.6 mg/(kg·d)1次灌胃，空白對照組及假手術(shù)組給予同體積生理鹽水日1次灌胃，給藥時間為造模前連續(xù)7 d及造模后24 h內(nèi)給藥1次。

1.2.2 建模及取材 實(shí)驗(yàn)動物采用改良的Longa法建立腦缺血卒中模型，術(shù)前12 h給予大鼠禁食水處理，術(shù)前應(yīng)用25 g/L的水合氯醛進(jìn)行大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉，大鼠仰臥位固定，作頸正中切口，分離出右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)，在近顱底處將翼腭動脈剝離，并將其起始部結(jié)扎，在ECA殘端剪一小孔，將魚線經(jīng)小孔插入ECA至ICA，插入約18 mm可感受輕微受阻，表明線頭端觸及大腦前動脈(ACA)近端壁，將大腦中動脈(MCA)起始部阻斷。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠有前肢為重的偏癱及右側(cè)Horner征。假手術(shù)組操作至剝離翼顎動脈結(jié)束。栓塞2 h后實(shí)行再灌注。再灌注24 h后每組取大鼠經(jīng)右側(cè)頸內(nèi)動脈灌注0.9%生理鹽水及4%多聚甲醛固定腦組織(n=12)，斷頭取腦后泡入多聚甲醛存于4 ℃留用；斷頭冰上活取海馬組織(n=6取材時間控制在1 min左右)。

1.2.3 指標(biāo)測定

1.2.3.1 行為學(xué)指標(biāo) Longa評分 0分：未見相關(guān)行為障礙；1 分：癱瘓側(cè)前爪無力；2分：行走向癱瘓側(cè)傾斜、轉(zhuǎn)圈；3分：行走向患側(cè)歪倒；4分：無肢體活動、意識喪失。

1.2.3.2 TTC染色 取-20 ℃凍存20～30 min左右腦組織質(zhì)地略硬的大鼠大腦組織，應(yīng)用刀片冠狀面方向?qū)⒄麄€腦組織平均切成5個切片，每層約2～3 mm厚，將其放入預(yù)先配置完成并于37 ℃水浴鍋中預(yù)熱的染料中染色20～30 min，觀察染色情況。

1.2.3.3 HE染色 取大腦海馬組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟與包埋，將蠟塊常規(guī)切片，HE染色觀察大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)改變。

1.2.3.4 ELISA法測定IL-1β、IL-6水平 取適量組織塊，在預(yù)冷PBS中(0.01 mol/L，pH=7.0～7.2)中清洗去除血液，切成小塊，均勻的放入放置在冰上的裝有新鮮裂解緩沖液中(質(zhì)量體積比1∶20～1∶50)，將得到的懸濁液經(jīng)超聲處理至澄清，勻漿液10 000 r/min離心5 min，取上清。實(shí)驗(yàn)前按說明書標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)際準(zhǔn)備；加樣100 μl，37 ℃孵育1 h；甩干，加檢測液A 100 μl，37 ℃孵育1 h；洗板3次；加檢測液B 100 μl，37 ℃孵育1 h；洗板5次；加TMB底物90 μl，37 ℃孵育10～20 min；加終止液50 μl，立即450 nm讀數(shù)。

1.2.3.5 Western Blot測定p-p38MAPK、NF-κB水平 將樣品去根蛋白提取試劑盒提取蛋白，復(fù)合物以12，000 r/min(10 min，4 ℃)離心后，獲取上清。用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定裂解物中的蛋白質(zhì)水平后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離40 μg蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用含0.1%Tween-20的TBS中的1%牛血清白蛋白在室溫下封閉膜2 h，TBST洗滌3次，用下列一抗溶液：抗p-p38MAPK抗體(1∶1000)抗NF-κB抗體(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，第二抗體室溫孵育2 h。使用ChemiDoc-ItTMTS2成像儀(UVP，LLC，Upland，CA，USA)顯影，并使用ImageJ2x軟件程序(National Institute of Health，Bethesda，MD，USA)進(jìn)行分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 行為學(xué)指標(biāo)結(jié)果 假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)；FTY720治療組神經(jīng)功能缺失評分與空白對照組(P<0.01)及氯吡格雷組(P<0.01)明顯降低(見圖2、圖3)。

注：與假手術(shù)組比較 △P<0.01；與空白對照組比較#P<0.01

2.2 TTC染色結(jié)果 假手術(shù)組大鼠腦組織未見梗死病灶，F(xiàn)TY720組大鼠梗死灶較空白對照組明顯減小(P<0.01)，較氯吡格雷組明顯減小(P<0.01)(見圖3、圖4)。

圖3 各組大鼠腦組織梗死情況

注：與假手術(shù)組比較 △P<0.01；與空白對照組比較#P<0.05

2.3 HE染色結(jié)果 假手術(shù)組大鼠海馬各區(qū)神經(jīng)元形態(tài)相對完整且飽滿，排列致密而有序，空白對照組、氯吡格雷治療組及FTY720治療組中發(fā)現(xiàn)C3區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)細(xì)胞萎縮，排列紊亂且稀疏，核固縮等現(xiàn)象，且可見有淋巴細(xì)胞浸潤，但FTY720組細(xì)胞改變程度及淋巴細(xì)胞浸潤明顯小于空白對照組及氯吡格雷組(見圖5)。

注：A：假手術(shù)組；B：對照組；C：氯吡格雷治療組；D：FTY720組

2.4 ELISA法測定海馬組織IL-1β及IL-6含量結(jié)果 FTY720組大鼠海馬組織IL-1β及IL-6含量較空白對照組(P<0.01)及氯吡格雷治療組均降低(P<0.01)；氯吡格雷組IL-1β、IL-6含量較空白對照組無明顯差異(P=0.452，P=0.133)(見圖6)。

注：與假手術(shù)組比較 △P<0.01；與空白對照組比較#P<0.01

2.5 Western-blot法測定海馬組織p-p38MAPK、NF-κB水平結(jié)果 FTY720組p-p38MAPK(P<0.01)及NF-κB(P<0.01)較空白對照組及氯吡格雷組明顯降低，氯吡格雷組較空白對照組p-p38MAPK及NF-κB水平明顯降低(P<0.01)(見圖7、圖8)。

注：A：假手術(shù)組；B：對照組；C：氯吡格雷組；D：FTY720組

注：與假手術(shù)組比較 △P<0.01；與空白對照組比較#P<0.01

3 討 論

腦缺血再灌注損傷機(jī)制錯綜復(fù)雜，國內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果迥異，如缺血腦組織炎癥因子釋放、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元凋亡等均影響缺血性卒中的預(yù)后，目前具體通過何種機(jī)制尚無明確定論。近年來在腦缺血卒中機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)炎癥因子扮演著重要角色，腦缺血發(fā)生后，一方面，外周淋巴組織釋放淋巴細(xì)胞分泌炎癥因子，淋巴細(xì)胞及炎癥因子向中樞遷徙，破壞血腦屏障，造成神經(jīng)組織損傷；另一方面，腦缺血后，釋放趨化因子，促使IL-1、IL-6及黏附分子等釋放[14]，引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步損傷腦組織，實(shí)驗(yàn)證明通過藥物減少IL-6、IL-23等炎癥因子的釋放，可減輕腦缺血性卒中動物模型的神經(jīng)缺損癥狀及腦組織結(jié)構(gòu)變化[15，16]。早期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p38MAPK/NF-κB通路是調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥因子釋放的關(guān)鍵通路之一[9，10，17]，同時，如前所述，p38MAPK參與小膠質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，從而影響炎癥反應(yīng)。大量實(shí)驗(yàn)證明在腦缺血卒中過程中p38MAPK水平明顯升高[18]，且有報道指出，應(yīng)用姜黃素、丁苯酞等藥物治療腦缺血卒中可改善神經(jīng)缺損癥狀，且相應(yīng)腦組織中p38MAPK明顯降低[19，20]，由此可知，p38MAPK通路在腦缺血性卒中發(fā)生過程中的重要地位，此過程可能與炎癥反應(yīng)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)TY720治療組大鼠的神經(jīng)功能評分明顯較空白對照組及氯吡格雷組高，在宏觀癥狀上說明其可改善缺血性卒中動物的神經(jīng)癥狀。有文獻(xiàn)曾指出FTY720可改善腦出血模型神經(jīng)缺損癥狀[7，8]、自閉癥模型的記憶、行為等癥狀[11]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了FTY720可改善腦缺血再灌注損傷模型神經(jīng)功能，從個體水平驗(yàn)證了FTY720的神經(jīng)保護(hù)作用。此外，F(xiàn)TY720治療組動物模型中腦組織HE染色顯示細(xì)胞形態(tài)變化及淋巴細(xì)胞浸潤程度較輕，其從細(xì)胞水平上對FTY720的神經(jīng)保護(hù)作用提供了證據(jù)。

FTY720的神經(jīng)保護(hù)作用已得到驗(yàn)證，為明確其神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)測定了大鼠海馬組織IL-1β、IL-6水平FTY720治療組較空白對照組及氯吡格雷組明顯降低，提示FTY720可降低缺血腦組織IL-1β、IL-6水平。大量實(shí)驗(yàn)證明炎癥反應(yīng)參與腦缺血卒中過程，IL-1β、IL-6水平在腦缺血卒中模型腦組織中明顯增高[14]，而另有實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大黃酚[21]、葛根素等[22]藥物治療后缺血卒中模型動物腦組織炎癥因子明顯減少，且改善模型動物腦缺血癥狀。本實(shí)驗(yàn)中FTY720組實(shí)驗(yàn)動物神經(jīng)功能得到改善，因此，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了FTY720可通過減輕炎癥反應(yīng)從而對局灶性缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。

p38MAPK信號通路在缺血性卒中腦組織中水平明顯升高，而應(yīng)用p38MAPK抑制劑、姜黃素等藥物干預(yù)后[23，24]，缺血性卒中動物模型神經(jīng)缺損癥狀得到改善，腦梗死面積縮小。p38MAPK/NF-κB通路是公認(rèn)的引起下游炎癥因子釋放的一個關(guān)鍵通路，且近年研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK與小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)[25]。本實(shí)驗(yàn)中FTY720治療組p-p38MAPK及NF-κB水平較空白對照組及氯吡格雷組明顯降低，氯吡格雷組二者水平較空白對照組降低，但炎癥因子水平變化不具統(tǒng)計學(xué)意義，因p38MAPK既存在于膠質(zhì)細(xì)胞亦存在于神經(jīng)元，考慮氯吡格雷的抗血小板聚集作用降低了由于手術(shù)操作內(nèi)皮損傷再栓塞，從而減少了神經(jīng)元損傷的可能，而FTY720組變化更為明顯提示FTY720與氯吡格雷二者合用既有抗血小板作用又聯(lián)合抗炎作用，從而達(dá)到更顯著的治療作用。由此可見FTY720改善缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能及降低炎癥反應(yīng)可能與p38MAPK途徑相關(guān)。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，F(xiàn)TY720可減輕缺血造成的神經(jīng)功能缺損及中樞炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)減輕的中樞機(jī)制一方面為p38MAPK通路對炎癥反應(yīng)的影響，另一方面為小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化對炎癥反應(yīng)的影響，而小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制目前尚不完善，文獻(xiàn)研究可能與p38MAPK通路、STAT3通路等相關(guān)[26]，本實(shí)驗(yàn)中p38MAPK水平變化雖與小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化趨勢一致，但尚不能得出二者存在必然聯(lián)系的結(jié)論，有待于進(jìn)一步研究探討。