談 峰，王 瑩，李玉娟

(江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 南通 226541)

鹽堿土的改良途徑有很多，但是重鹽堿地的改良必先從高耐鹽植物的種植開始，而林木的利用是最高效的。但在自然界中可供利用的高耐鹽林木資源極其匱乏，改良林木的耐鹽性是一個重要的擴展資源的途徑，育種改良固然是一個可行的途徑，但其周期長、效率低，目前的研究認(rèn)為可以通過利用改良基質(zhì)先行以提高植物耐鹽性，進(jìn)而在土壤中實際應(yīng)用少量基質(zhì)而達(dá)到讓低耐鹽樹種在中高含鹽量土地上存活并逐步適應(yīng)生長[1]，而在這個技術(shù)途徑中的一個關(guān)鍵因子是高耐鹽菌株及其可利用途徑的獲得。

自然界中高耐鹽微生物是存在的，主要以土壤生境和植物內(nèi)生生境的方式存在，而針對研究目的而言，植物內(nèi)生耐鹽菌是首選的研究對象，尤其以植物內(nèi)生耐鹽細(xì)菌為優(yōu)。

植物內(nèi)生細(xì)菌(Endophytic bacteria)是指能在健康植物組織內(nèi)棲居，而對植物不造成任何實質(zhì)性危害的微生物[2]。從植物根瘤菌的開發(fā)應(yīng)用到茯苓的大規(guī)模人工栽培，無不表現(xiàn)出植物共生菌在人類改造自然、應(yīng)用自然中的主觀能動性的積極作用。在提高植物對鹽堿條件的適應(yīng)性方面，共生菌也存在天然的優(yōu)勢。有研究表明，內(nèi)生細(xì)菌能夠促進(jìn)植物生長、促進(jìn)生物固氮、增強宿主抗病蟲害、抗逆能力等。Mason發(fā)現(xiàn)鹽漬土植物共生菌對改進(jìn)植物在鹽漬土上的生長，提高植物耐鹽性有著極大的作用[3]。Gupta等發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下對玉米接種AM真菌在不施用磷肥的條件下與不接種AM真菌但施用磷肥的植株生長量相當(dāng)[4]。植物體內(nèi)外存在大量種類豐富、功能多樣的微生物。近年來，高通量測序等多種組學(xué)技術(shù)的發(fā)展揭示了植物地下微生物群體的菌群結(jié)構(gòu)和功能，從生態(tài)和進(jìn)化角度去探討植物的耐鹽策略備受關(guān)注。井大煒等研究發(fā)現(xiàn)，在一些鹽生植物中也含有這些有類似功能的菌，如嗜鹽菌，而這些菌是具有增強植物耐鹽力的能力的[5]。Bu等研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌可以有效保護(hù)水稻葉片保護(hù)酶系統(tǒng)，從而提高水稻的耐鹽堿性[6]。在研究特定基質(zhì)時，魏琦等通過對一些植物的特定共生菌的研究發(fā)現(xiàn)，某些植物在接種了特定耐鹽菌后[7]，植物的生長，尤其是在不良條件下的生長能力得到了極大的提高。筆者在篩選高耐鹽菌的過程中，從海灘淺水和瀕水植物中分離提純高耐鹽微生物，最終在淺水大米草的根系內(nèi)部發(fā)現(xiàn)了一株高耐鹽的菌株，經(jīng)過系統(tǒng)的試驗研究，結(jié)果顯示其具有提高植物耐鹽性的功能，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分離材料 攜菌植株：大米草(SpartinaanglicaHubb.)樣本在江蘇如東海灘淺水處取得，挖取過程中保留完整根系，在海水中洗去泥沙，封存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 高鹽PDA培養(yǎng)基 高鹽PDA培養(yǎng)基：海水(含鹽2%)1000 mL、土豆200 g、瓊脂14 g、牛肉浸膏12 g、精解蛋白胨10 g。按常規(guī)PDA培養(yǎng)基制作方法制作，裝試管，125 ℃下滅菌25 min，擺斜面。擴大培養(yǎng)試驗以培養(yǎng)皿為容器。

育苗基質(zhì)：配料為木腐菌糠30%、秸稈20%、雙孢蘑菇菌糠50%、菌糠料和秸稈料拌和均勻，腐熟發(fā)酵；配以鹽濃度2%的選菌發(fā)酵液，最后培養(yǎng)料的含鹽量調(diào)至0.6%供試驗用。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離與純化 取植株的根系，經(jīng)過無菌水沖洗，截取尖端組織，在無菌條件下經(jīng)過無菌操作，取根尖內(nèi)部組織于試管中，30 ℃下無菌培養(yǎng)。將分離獲得的不同菌株分別培養(yǎng)，提純培養(yǎng)，得到純化的菌株。

1.2.2 微生物形態(tài) 通過對微生物個體及菌落的形態(tài)觀察，初步界定菌物分類地位。

1.2.3 菌株對提高植物耐鹽性的初步鑒定 以獲得的菌株單菌落擴大培養(yǎng)，制成以獲得菌為主導(dǎo)群的特殊基質(zhì)，以杜梨為試驗植物，檢驗菌物對提高植物耐鹽能力的作用，確定內(nèi)生菌對杜梨耐鹽性的影響,選定適合菌株。

以28 cm×17 cm花盆為容器移栽杜梨，根部分洗凈處理。每樣本50株，地徑1 cm，定高50 cm，全去葉，以含鹽2%的海水噴霧基質(zhì)表面保持基質(zhì)濕潤。記錄植株發(fā)芽的情況。生長穩(wěn)定后，取樣測量根系萌發(fā)數(shù)量與生長長度，以根系萌發(fā)并健康生長為指標(biāo)來確定杜梨是否成活。

1.2.4 菌株鑒定 以表現(xiàn)優(yōu)良者，擴大培養(yǎng)，顯微鏡觀察菌落形態(tài)。以基因測序的方法鑒定菌株分類地位。

革蘭氏染色、基因測序鑒定。測定步驟：基因組抽提、PCR擴增、測序、物種鑒定。內(nèi)生菌的16S DNA片段分析。

采用蛋白酶K裂解的方法進(jìn)行基因組DNA抽提，以8F(5′)AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R(3′)TACGGYTACCTTGTTAYGACTT為引物進(jìn)行PCR擴增。表1～表3為測序所用的標(biāo)準(zhǔn)物。

PCR產(chǎn)物檢測:取3 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定結(jié)果是否可以用于測序。

表2 PCR體系

表3 PCR程序

1.3 耐鹽能力的鑒定

按含鹽度2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%設(shè)置PDA培養(yǎng)基,培養(yǎng)皿培菌，接種菌株，30 ℃無菌培養(yǎng)，觀察、記錄菌株生長情況，判定菌株的耐鹽能力。

2 結(jié)果與分析

利用植物根尖內(nèi)部組織切片置于專業(yè)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得菌株，經(jīng)過反復(fù)分離提純，獲得3個不同表現(xiàn)的細(xì)菌菌株——B1、B2、B3,結(jié)果見圖1。分離的結(jié)果說明，在淺海水環(huán)境下生活的植物體內(nèi)含有耐鹽菌，這類菌物能與植物在鹽生條件下共同生長，并不會造成對植物的傷害。

2.1 具備促進(jìn)植物在鹽生條件下的菌株選擇

經(jīng)過擴大培養(yǎng)，制成含耐鹽菌的3個基質(zhì)，經(jīng)過裸根移栽杜梨的試驗，證明有1個菌株具有提高植物耐鹽性的功能，標(biāo)記為B2，結(jié)果見表4。

表4 3個菌株對杜梨在鹽生條件下生根率的影響

試驗的結(jié)果說明，并不是所有的植物內(nèi)生耐鹽菌都具有促進(jìn)植物在鹽生條件下生根成活的能力的，B2菌具有較高的提高植物耐鹽性的能力。

B2菌的耐鹽能力：通過對B2菌在不同含鹽濃度的培養(yǎng)皿中的試驗研究，結(jié)果顯示，B2菌可以在飽和鹽濃度以下和基質(zhì)中正常生長發(fā)育，區(qū)別是菌株恢復(fù)生長的時間不同，結(jié)果見表5。這說明B2菌是一株極度耐鹽的菌株。

表5 B2菌在不同鹽濃度條件下的生長時間

在得到初步結(jié)果后，又對10%和15%鹽濃度間進(jìn)一步分級試驗，結(jié)果在鹽濃度達(dá)到13%時，菌株恢復(fù)生長時間開始延長。由此說明，在不同鹽濃度條件下，當(dāng)菌株恢復(fù)生長后，生長速度不再受鹽濃度的影響。

2.2 B2菌的鑒定

以接種環(huán)取菌，劃線培養(yǎng)，結(jié)果顯示：菌落乳白色，圓珠狀(圖1)。在顯微鏡下觀察，單細(xì)胞形態(tài)為無色，長卵圓形，頂側(cè)芽分裂生長，對比形態(tài)，屬于細(xì)菌類(圖2)。B2菌株革蘭氏染色結(jié)果為紅色，說明為陰性菌。

2.3 測序結(jié)果

16S V1～V9片段大小約為1500 bp，雙端測序結(jié)果進(jìn)行拼接，由于測序起始端測序質(zhì)量較差，所以筆者去除了質(zhì)量較差的序列。測序結(jié)果(圖3、圖4)顯示B2樣本測序峰單一，說明品種單一。

拼接：FLASH v1.2.11 默認(rèn)參數(shù)；質(zhì)量過濾：seqtk v1.2 默認(rèn)參數(shù)；序列結(jié)果見圖5。

2.4 Blast比對結(jié)果

經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果測試菌株與數(shù)據(jù)庫中相似性最高的前10位及物種分類信息統(tǒng)計結(jié)果見表6。

Pseudomonasplecoglossicida從已知文獻(xiàn)的報道中可以知道是魚類的致病菌[8]，在植物中未見相關(guān)報道，Pseudomonastaiwanensis是一種土壤中分離的菌[9]，對砷元素有富集隔離作用，已知同屬中的菌株未見有相同功能的報道，且基因序列不完全重復(fù)。

2.5 比對結(jié)果物種分類信息的注釋

從表7中所列已知菌株的注冊信息看，本次分離獲得的菌株在Pseudomonas下無相同菌株，所列10個最相近菌株的注冊地位在屬以上完全相同，從基因測序的結(jié)果說明，新菌株屬于Pseudomonas屬，種上沒有相同的菌株。

表7 前10個物種的各級別物種信息注釋

2.6 發(fā)育樹

B2菌的16S rDNA序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST對比后得到一系列的結(jié)果，選取與同源性比對得到的10個同屬不同種相似菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果見圖6。

從測序結(jié)果的BLAST比對數(shù)據(jù)中可以看到，10個相近菌株中，測序菌株與NR 115336.1和NR 040859.1兩個編號的菌株關(guān)系最遠(yuǎn)，相似度99.006%；與NR 114226.1和NR 024662.1關(guān)系最近，相似度為99.645%。這首尾的4個菌株的屬分類地位一致，均為Pseudomonas屬，10個相似菌株的比對結(jié)果構(gòu)成新測序菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，說明該菌來自于Pseudomonas屬，是一個未見報道的種。

2.7 鑒定結(jié)果

基因測序的結(jié)果顯示，在物種庫中沒有與所得菌株完全一致的已知菌株，綜合測試的各項指標(biāo)結(jié)果，測試菌株為一個未見注冊的菌株，新獲得菌株極可能是一個新的物種，暫名為PseudomonasG。

表8 菌株測序鑒定結(jié)果

3 討論

菌類參與植物生命活動并提高植物抗逆性，促進(jìn)植物在不良環(huán)境下的移栽成活率是客觀的事實，根際菌類是最直接的作用菌[10-12]。外生菌是以改善環(huán)境條件的方式作用于植物，而內(nèi)生菌則是在植物體內(nèi)以改善植物體自身對不良環(huán)境的耐受力而發(fā)揮作用的[13]，所以從作用的方式上講，內(nèi)生菌對外生菌有著更廣泛的應(yīng)用前景。以鮮活植物為供體分離體內(nèi)菌株，尋找可以促進(jìn)植物在鹽生條件下移栽成活的目標(biāo)菌株，排除了菌株與植物互害的風(fēng)險，分離菌株的培養(yǎng)基含鹽量為2%。在此基質(zhì)上生長的菌類在耐鹽能力上屬于高耐鹽菌，由于是采用健康的鮮活植物內(nèi)部組織分離的技術(shù)途徑獲得的菌株，說明所獲得的菌株對植物的生長沒有危害性。極限耐鹽力為0.4%的杜梨，經(jīng)過在含鹽0.6%、混合了耐鹽菌株的培養(yǎng)基的鑒定性栽培試驗，在含B2菌的基質(zhì)中生根成活率達(dá)84%，其他菌株不能生根成活，證明分離到的新菌株B2具有明顯的提高植物耐鹽能力的作用。通過測序鑒定，在目前已知資料庫中沒有相同的菌株，而相似菌株也未見有類似功能，所以新菌株B2是一個未見報道的新菌株。新菌株鑒定過程中僅做了耐鹽力、對植物在較高鹽濃度條件下提高成活率的試驗研究，但對其作用機理未做深入的研究，對植物耐鹽能力的提高極限也沒有作出深入的研究，這些工作將會在今后的工作中進(jìn)行。