王亮亮,王倩倩,朱瑩瑩 ,龐子峰,朱玉喜,植嬋萍,潘玉善,劉建華,賀丹丹*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué),河南 鄭州 450000；2.廣東茂名農(nóng)林科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東 茂名 525000)

F33∶A-∶B-型質(zhì)粒是多重耐藥質(zhì)粒IncF型質(zhì)粒中最為流行的亞型之一,它廣泛存在于腸桿菌科細菌,尤其是大腸桿菌中,是介導(dǎo)fosA3、blaCTX-Ms和rmtB等耐藥基因快速傳播的主要載體[1-3]。F33∶A-∶B-型質(zhì)粒除了能夠借助IS26和IS1294元件捕獲和傳播抗性基因外,還能夠獲得IncN1、IncI1、IncR和IncX1型質(zhì)粒的一些片段成為多復(fù)制子質(zhì)粒[3]。本課題組在研究豬源大腸桿菌中mcr-1的水平轉(zhuǎn)移能力時,首次發(fā)現(xiàn)在接合過程中,F33∶A-∶B-型質(zhì)粒pD72-F33捕獲了大約96 kb的mcr-1陽性類噬菌體質(zhì)粒pD72-mcr-1形成融合質(zhì)粒pD72C；序列分析發(fā)現(xiàn),其質(zhì)粒融合機制是pD72-F33上1個拷貝的IS26攻擊pD72-mcr-1上8 bp的目標位點(CAGCATTT)[4]。

質(zhì)粒介導(dǎo)的粘菌素耐藥基因mcr-1已經(jīng)成為全球關(guān)注的重點。自2015年mcr-1被首次報道后,該基因在世界范圍內(nèi)不同來源的不同菌種中廣泛出現(xiàn)[5-7]。不同的mcr-1陽性不相容群質(zhì)粒不斷被報道,尤其是較流行的IncI2、IncX4和 IncHI2型質(zhì)粒,它們所具有的較高的穩(wěn)定性和適應(yīng)性優(yōu)勢對mcr-1的快速傳播起到重要作用[8-10]。除了可接合性質(zhì)粒,Tn6330 (ISApl1-mcr-1-ISApl1)與mcr-1的快速傳播密切相關(guān),Tn6330能夠通過形成環(huán)形中間體形式促使mcr-1插入到其它細菌的染色體或質(zhì)粒的TA富集區(qū)[11-14]。目前報道的mcr-1陽性類噬菌體質(zhì)粒具有較高的核酸序列同源性,其中大多數(shù)不具有自身轉(zhuǎn)移性,因此這類質(zhì)粒對mcr-1的快速水平傳播作用具有局限性[4]。本研究中的mcr-1陽性類噬菌體質(zhì)粒pD72-mcr-1具有不可接合性,然而,可接合性F33∶A-∶B-型質(zhì)粒與之融合后的共整合質(zhì)粒具有可接合性,這暗示F33∶A-∶B-型質(zhì)粒能夠作為1個接合輔助質(zhì)粒提供給不可接合質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力,進而促使mcr-1的快速傳播[4]。質(zhì)粒融合使質(zhì)粒進化成攜帶更多耐藥基因的質(zhì)粒,然而該融合質(zhì)粒在受體菌中是否能夠穩(wěn)定存在？對受體菌是否產(chǎn)生適應(yīng)性代價？對該融合質(zhì)粒的融合頻率和接合頻率也不清楚。鑒于此，我們研究了該融合質(zhì)粒的生物學(xué)特性,評估了攜帶mcr-1多重耐藥融合質(zhì)粒在宿主菌中的適應(yīng)性、融合和擴散能力,旨在為多重耐藥融合質(zhì)粒介導(dǎo)mcr-1傳播的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株信息

大腸桿菌D72菌株分離自豬肛門拭子樣品;接合實驗得到攜帶融合質(zhì)粒pD72C(blaCTX-M-55陽性F33∶A-∶B-型質(zhì)粒pD72-F33與mcr-1陽性類噬菌體質(zhì)粒pD72-mcr-1的共整合質(zhì)粒)的接合子D72C、攜帶pD72-F33質(zhì)粒的接合子D72C-2。標準菌E.coli25922及工程菌E.coliDH5α、E.coliC600、E.coliJ53為本實驗室保存。采用微量肉湯稀釋法測定原菌、受體菌及接合子的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)。

1.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實驗

用小提質(zhì)粒試劑盒分別提取兩個接合子的質(zhì)粒,通過電轉(zhuǎn)化分別將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌E.coliDH5a中,獲得攜帶pD72C的轉(zhuǎn)化子D1和攜帶pD72-F33的轉(zhuǎn)化子D2。

1.3 生長曲線測定

將接合子D72C、D72C-2和E.coliC600劃線培養(yǎng)后,分別挑取單菌落到2 mL空白LB肉湯中,于37 ℃下以200 r/min的轉(zhuǎn)速過夜培養(yǎng)。分別測定接合子D72C、D72C-2的母液的OD值,取OD值最接近的母液進行下一步實驗。從母液中吸取200 μL接種到含20 mL新鮮LB肉湯的錐形瓶中,在37 ℃下以200 r/min震蕩培養(yǎng)。每隔1 h準確吸取200 μL到96孔板中,平行吸取3次,以空白的LB肉湯作為空白對照,測定在600 nm處的吸光值OD600。

1.4 質(zhì)粒穩(wěn)定性實驗

將接合子D72C和D72C-2分別劃線于LB瓊脂培養(yǎng)基上,在37 ℃下過夜培養(yǎng)。挑取單菌落，將其接種至50 mL無抗LB肉湯中，過夜傳代培養(yǎng),每株菌3個平行。吸取50 μL培養(yǎng)液，重復(fù)接種至新的50 mL無抗LB肉湯中，連續(xù)傳代9 d。每隔1 d進行1次檢測,吸取20 μL細菌培養(yǎng)液,用滅菌生理鹽水倍比稀釋到合適濃度,在無抗LB瓊脂培養(yǎng)基上均勻地滴稀釋液,每個稀釋梯度滴3個平行,過夜培養(yǎng)。參照本課題組先前研究報道[4]中的引物,對在無抗LB瓊脂平板上生長的所有菌落進行PCR鑒定。

1.5 體外競爭性實驗

為了評估融合質(zhì)粒pD72C和親本質(zhì)粒pD72-F33對宿主適應(yīng)性的影響,采用轉(zhuǎn)化子D1、D2與E.coliDH5a進行體外競爭實驗。挑取D1和E.coliDH5a,分別接種于2 mL無抗LB肉湯中,于37 ℃、200 r/min搖床上培養(yǎng)12～16 h。取OD600值最相近的初始培養(yǎng)物母液,以1∶1的比例均勻混合。分別取100 μL混合液接種到100 mL空白LB肉湯中(1∶1000),同時設(shè)4個平行,設(shè)此時為競爭性實驗0 h。于37 ℃、200 r/min條件下震蕩培養(yǎng)24 h后,取混合液100 μL接種到100 mL新鮮空白LB肉湯中(1∶1000)。此操作每24 h重復(fù)1次,連續(xù)4 d。在培養(yǎng)的0、24、48、96 h時,對混合培養(yǎng)物各取50 μL培養(yǎng)液,利用滅菌生理鹽水將其倍比稀釋到合適的濃度，然后涂布于無抗LB瓊脂板,在37 ℃下培養(yǎng)14～18 h。將從LB瓊脂板上獲得的單菌落全部轉(zhuǎn)接到2 μg/mL粘菌素LB瓊脂板上,于37 ℃恒溫下培養(yǎng)14～18 h。參照文獻[4]報道的引物,進行菌落PCR鑒定。轉(zhuǎn)化子D2的體外競爭實驗也進行相同的操作。最后,參照文獻[15]的報道,根據(jù)以下公式計算相對適應(yīng)度RF：RF=(lgS1d1-lgS1d0)/(lgS2d1-lgS2d0),式中S1d1和S1d0分別是轉(zhuǎn)化子在24、48、72、96和0 h時的菌落數(shù)；S2d1和S2d0分別是DH5a在24、48、72、96和0 h時的菌落數(shù)。當(dāng)RF>1時,表明轉(zhuǎn)化子相對于宿主菌有競爭優(yōu)勢;當(dāng)RF=1時,表明質(zhì)粒對宿主菌不產(chǎn)生適應(yīng)性代價;當(dāng)RF<1時,說明質(zhì)粒對宿主菌造成了較大的適應(yīng)性代價,轉(zhuǎn)化子處于競爭劣勢。體外競爭性實驗重復(fù)3次,結(jié)果取RF的平均值。

1.6 質(zhì)粒的融合頻率和接合頻率

以原菌D72為供體,以利福平抗性E.coliC600為受體,通過接合實驗觀察pD72-mcr-1和pD72-F33∶A-∶B-融合質(zhì)粒的形成能力。分別在添加頭孢噻肟(2 mg/L)和利福平(450 mg/L)的麥康凱瓊脂板上，以及添加黏菌素(2 mg/L)和利福平(450 mg/L)的麥康凱瓊脂板上篩選接合子。進一步以攜帶融合質(zhì)粒pD72C和攜帶pD72-F33質(zhì)粒的接合子D72C和D72C-2為供體,以疊氮鈉抗性E.coliJ53為受體進行接合實驗,在含有黏菌素(2 mg/L)和疊氮鈉(100 mg/L)、頭孢噻肟(2 mg/L)和疊氮鈉(100 mg/L)的瓊脂板上篩選J53接合子,以評價融合質(zhì)粒和親本質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移能力。參照文獻[4]報道的引物,對所有接合子進行PCR鑒定。融合頻率的計算:融合頻率=攜帶融合質(zhì)粒pD72C的接合子數(shù)量/攜帶親本質(zhì)粒pD72-F33的接合子數(shù)量。接合頻率計算:接合頻率=接合子數(shù)量/ (C600數(shù)量+接合子數(shù)量)。

2 結(jié)果與分析

2.1 接合子及原菌的藥敏性

從表1可以看出：原菌D72對多種藥物耐藥；攜帶融合質(zhì)粒的接合子D72C對頭孢喹肟和粘菌素的MIC值比受體菌分別升高了約512倍和64倍；blaCTX-M-55陽性質(zhì)粒pD72-F33的接合子D72C-2對粘菌素敏感,而對頭孢喹肟的MIC值比受體菌升高了約512倍。這些耐藥表型與接合子攜帶的耐藥基因一致。

表1 大腸桿菌分離株D72、接合子及受體菌的MIC值 mg/L

2.2 細菌的生長曲線

以時間(h)為橫坐標,以不同時間點的平均OD600值為縱坐標,繪制 D72C、D72C-2和E.coliC600的生長曲線。最初D72C、D72C-2和E.coliC600母液的OD600值比較接近,分別為0.035、0.033和0.031。圖1顯示,所有菌株均在4 h時達到對數(shù)期,在10 h時達到穩(wěn)定期,且各時間節(jié)點的OD600值相近,3株菌的生長曲線趨于一致,即接合子和受體菌的生長能力相似。

2.3 質(zhì)粒的穩(wěn)定性和競爭性

質(zhì)粒的穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示,在不含抗生素的環(huán)境中,融合質(zhì)粒pD72C和親本質(zhì)粒pD72-F33連續(xù)傳代9 d后仍能保持穩(wěn)定存在,說明該質(zhì)粒具有較高的穩(wěn)定性,其攜帶的抗性基因可以穩(wěn)定遺傳。競爭性實驗結(jié)果(圖2)顯示,在培養(yǎng)過程中,攜帶融合質(zhì)粒pD72C的轉(zhuǎn)化子D1和攜帶親本質(zhì)粒pD72-F33的轉(zhuǎn)化子D2數(shù)量都高于受體菌E.coliDH5a的數(shù)量,相對適應(yīng)度RF均大于1,說明融合質(zhì)粒pD72C和親本質(zhì)粒pD72-F33對宿主菌均呈現(xiàn)出適應(yīng)性優(yōu)勢。融合質(zhì)粒pD72C的相對適應(yīng)性高于pD72-F33的相對適應(yīng)性,尤其是在96 h時,質(zhì)粒pD72-F33的相對適應(yīng)度性稍微降低,而融合質(zhì)粒pD72C的突然增大,表現(xiàn)出比pD72-F33更明顯的競爭優(yōu)勢。

2.4 質(zhì)粒的融合頻率和接合頻率

實驗結(jié)果表明：質(zhì)粒的融合頻率較高,為6.43×10-3；融合質(zhì)粒pD72C和親本質(zhì)粒pD72-F33的接合頻率分別為0.82×10-1和3.19×10-1。

3 討論

適應(yīng)性是指耐藥菌在沒有藥物選擇壓力的情況下生長、定殖等方面的能力。細菌在藥物的選擇壓力下,可以通過染色體基因突變和質(zhì)粒上耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移等獲得耐藥性以適應(yīng)環(huán)境的變化,但是當(dāng)藥物選擇壓力去除后,耐藥菌株中基因的突變、外源基因的表達以及質(zhì)粒的導(dǎo)入等會對宿主菌造成負擔(dān),其適應(yīng)性可能低于敏感菌,在菌群中逐漸成為劣勢菌,這一現(xiàn)象稱為適應(yīng)性代價。一般說來,質(zhì)粒和染色體抗性基因都會導(dǎo)致細菌適應(yīng)性代價的產(chǎn)生[16]。耐藥菌的適應(yīng)性研究主要包括耐藥菌是否能快速適應(yīng)宿主或環(huán)境?能否在與敏感菌的生長競爭中成為優(yōu)勢菌群？質(zhì)粒的穩(wěn)定性是指質(zhì)粒經(jīng)復(fù)制后分配到子代細菌中的能力。耐藥質(zhì)粒在宿主菌中穩(wěn)定的傳代可以保證耐藥性的維持,同時有更多的機會傳遞到其他菌中,增加耐藥基因傳播的機會。

本文通過融合質(zhì)粒的穩(wěn)定性、生長競爭性實驗，以及融合頻率和接合頻率來研究融合質(zhì)粒的生物學(xué)特征,以評估在接合過程中形成的多重耐藥融合質(zhì)粒對宿主菌的適應(yīng)性、融合和擴散能力。本研究通過測定生長曲線、質(zhì)粒穩(wěn)定性、體外競爭實驗來分析mcr-1陽性類噬菌體質(zhì)粒與blaCTX-M-55陽性F33∶A-∶B-型質(zhì)粒共整合形成的融合質(zhì)粒對宿主的適應(yīng)性代價。發(fā)現(xiàn)接合子D72C、D72C-2和E.coliC600的生長曲線基本一致,表明該融合質(zhì)粒不影響宿主菌的生長能力。融合質(zhì)粒和親本質(zhì)粒pD72-F33在無抗條件下能夠穩(wěn)定傳代9 d,這表明通過共整合形成的融合質(zhì)粒比較穩(wěn)定,有促進多重耐藥菌株形成的可能。體外競爭實驗結(jié)果表明融合質(zhì)粒和親本質(zhì)粒不對宿主菌產(chǎn)生適應(yīng)性代價。何良英等[17]報道了犬源大腸桿菌7A8的F33∶A-∶B-型多重耐藥質(zhì)粒pHN7A8在宿主菌JM109中具有較高的穩(wěn)定性和適應(yīng)性。F33∶A-∶B-型質(zhì)粒上存在的一些沉溺系統(tǒng)可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性和適應(yīng)性,這可能是F33∶A-∶B-型質(zhì)粒在腸桿菌中流行的主要原因[1]。本研究發(fā)現(xiàn),攜帶融合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子的相對適應(yīng)性高于親本質(zhì)粒的相對適應(yīng)性,尤其是在培養(yǎng)96 h時,融合質(zhì)粒的相對適應(yīng)性突然增大,這表明質(zhì)粒融合后,并沒有因為獲得較大序列片段而增加宿主的負擔(dān),反而有利于宿主的生存,其具體的原因有待進一步研究。本研究結(jié)果顯示，該融合質(zhì)粒具有較高的融合頻率和接合頻率,說明可接合性F33∶A-∶B-質(zhì)粒能夠以較高的頻率捕獲不可接合性mcr-1陽性類噬菌體質(zhì)粒,進而促進mcr-1的水平傳播,并且在捕獲類噬菌體質(zhì)粒這個較大的片段后,F33∶A-∶B-質(zhì)粒自身的轉(zhuǎn)移性和適應(yīng)性不受到影響。本研究中攜帶mcr-1的類噬菌體質(zhì)粒本身不具有可接合性,而該質(zhì)粒通過與可接合的blaCTX-M-55陽性F33∶A-∶B-型質(zhì)粒pD72-F33融合,不僅使自身具有了可接合性,而且不對宿主菌產(chǎn)生適應(yīng)性代價,同時有著較高的融合頻率和接合頻率。該融合質(zhì)粒所具有的良好的生物學(xué)特性可能會促使mcr-1的快速傳播及多重耐藥質(zhì)粒的進化,這將導(dǎo)致多重耐藥菌的產(chǎn)生,從而給臨床感染治療帶來挑戰(zhàn)。以后應(yīng)進一步研究影響質(zhì)粒融合的因素,為采取相應(yīng)措施避免多重耐藥融合質(zhì)粒的形成及傳播提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

mcr-1陽性類噬菌體質(zhì)粒和F33∶A-∶B-質(zhì)粒共整合形成的融合質(zhì)粒在宿主菌中能夠穩(wěn)定傳代,對宿主菌有較好的適應(yīng)性優(yōu)勢,擁有較強的擴散能力。