勾旭升，李華哲，李 覓，張 睿，陳立民

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院骨科，黑龍江哈爾濱 150001）

軟骨肉瘤是來源于軟骨細(xì)胞的惡性腫瘤，患病率占全部惡性骨腫瘤的16.1%［1］，好發(fā)于長骨近端及四肢帶骨，常見于40～70歲中老年人［2］。因其對放化療不敏感，常需要手術(shù)切除及肢體重建［3］。但微小病灶的殘留易造成腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，因此尋找有效抑制軟骨肉瘤的藥物成為骨腫瘤領(lǐng)域亟待解決的問題。槲皮素是存在于多種中藥及食物中的黃酮類化合物，近年來研究表明，槲皮素能夠有效抑制肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、骨肉瘤等腫瘤細(xì)胞，但其作用機(jī)制尚存在爭議［4～5］。為此，本研究將槲皮素加入體外培養(yǎng)的軟骨肉瘤細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞線粒體功能的影響，并探討其作用機(jī)制，為軟骨肉瘤的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理

軟骨肉瘤細(xì)胞（SW1353）源自美國菌種保藏中心（ATCC），槲皮素、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）激動(dòng)劑740Y-P購自美國MedChemExpress公司，Western檢測抗體購自沈陽萬類公司，其余試劑均購自上海碧云天公司。細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿80%培養(yǎng)瓶后傳代。將細(xì)胞隨機(jī)分為加藥組、激動(dòng)劑組、空白對照組，每組6個(gè)樣本。加藥組加入200 μg/ml槲皮素；激動(dòng)劑組加入200 μg/ml槲皮素及20 μmol/L 740Y-P；空白對照組僅SW1353作為空白對照。藥物干預(yù)48h后對細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測。

1.2 細(xì)胞活性檢測

細(xì)胞活性檢測采用CCK-8試劑盒。3組細(xì)胞消化后，各取100 μl加入96孔板中，37℃孵育24 h。每孔加入CCK-8溶液10 μl，37℃孵育1 h后，酶標(biāo)儀（Bio-Rad iMark，美國）測定各孔樣本在450nm處的吸光值（A），以A測得值-A空白孔為各孔實(shí)際吸光值A(chǔ)450。并計(jì)算各樣本細(xì)胞活力，細(xì)胞活力（%）=（A加藥組或激動(dòng)劑組-A空白孔）/（A空白對照組-A空白孔）×100%，其中A空白對照組取空白對照組6個(gè)樣本的平均值。

1.3 線粒體膜電位檢測

線粒體膜電位（ΔΨm）檢測采用JC-1熒光探針。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L，取0.5 ml加入0.5 ml JC-1工作液混勻。37℃孵育20 min，600g、4℃離心4 min，向沉淀中加入1 ml JC-1緩沖液（1X），再次600 g、4℃離心4 min，洗滌兩次。加入1 ml JC-1緩沖液（1X）重懸，取200 μl加入96孔板中，使用熒光分光光度計(jì)（Hitachi F4500，日本）測量JC-1單體 （A單）和聚合體（A聚）吸光值。A單激發(fā)光490 nm，發(fā)射光530 nm；A聚激發(fā)光525 nm，發(fā)射光590 nm。以A聚/A單的比值評估ΔΨm水平。

1.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測

細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平檢測采用活性氧檢測試劑盒。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L，取1 ml，600 g、4℃離心4 min，棄上清。根據(jù)試劑盒說明書，1 μl DCFH-DA加入1 ml DMEM/F12后重懸、混勻，37℃中孵育20 min。孵育后600 g、4℃離心4 min，棄上清，DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌3次。取200 μl加入96孔板中，熒光分光光度計(jì)測量吸光值（AROS）。激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光波長525 nm。

1.5 p-Akt表達(dá)水平檢測

使用Western blot方法檢測Akt、p-Akt表達(dá)水平。細(xì)胞裂解后測定樣本蛋白含量。煮沸后-80℃保存?zhèn)溆?。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。TBST洗膜后分別加入抗 Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶500）一抗 4℃孵育過夜。加入IgG二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光后，使用Image J 1.5b軟件分析灰度值。以p-Akt/Akt比值評價(jià)p-Akt表達(dá)水平。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測

采用Western blot方法測定細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2表達(dá)水平。提取細(xì)胞內(nèi)的總蛋白后，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜后，加入抗Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）一抗4℃孵育過夜，GAPDH（1∶2 000）作為內(nèi)參。加入IgG二抗（1∶5 000）室溫孵育2h。ECL曝光后，使用Image J 1.5b軟件分析灰度值。以Bax/GAPDH、Bcl-2/GAPDH比值評價(jià)細(xì)胞凋亡水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 槲皮素對細(xì)胞活性影響

空白對照組SW1353細(xì)胞排列密集，細(xì)胞間多呈三角形排列；加藥組細(xì)胞密度減低，細(xì)胞間排列混雜，無規(guī)律；激動(dòng)劑組細(xì)胞形態(tài)介于二者之間。細(xì)胞活性檢測結(jié)果見表1，三組A450比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中加藥組細(xì)胞A450低于激動(dòng)劑組及空白對照組，激動(dòng)劑組A450低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以空白對照組為參考計(jì)算細(xì)胞活力，加藥組細(xì)胞活力低于激動(dòng)劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 細(xì)胞活性檢測結(jié)果（±s）

表1 細(xì)胞活性檢測結(jié)果（±s）

images/BZ_67_1301_2566_1486_2635.pngimages/BZ_67_1486_2566_1674_2635.pngimages/BZ_67_1674_2566_1901_2635.pngimages/BZ_67_1901_2566_2129_2635.png指標(biāo)A450加藥組0.48±0.11激動(dòng)劑組0.73±0.13空白對照組0.92±0.13 P值<0.001 0.005

2.2 槲皮素對線粒體膜電位的影響

加藥組 ΔΨm（0.69±0.04）低于激動(dòng)劑組（1.11±0.11）及空白對照組（1.18±0.09），三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。組內(nèi)比較，加藥組ΔΨm明顯低于激動(dòng)劑組（P<0.001）及空白對照組（P<0.001，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。激動(dòng)劑組與空白對照組比較，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.203）。

2.3 槲皮素對細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響

加藥組細(xì)胞內(nèi)ROS含量（0.64±0.07）高于激動(dòng)劑組（0.57±0.03）及空白對照組（0.54±0.04），三者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008）。組內(nèi)比較，加藥組ROS高于激動(dòng)劑組（P=0.024）及空白對照組（P=0.003），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。激動(dòng)劑組與空白對照組ROS比較，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.288）。

2.4 槲皮素對p-Akt表達(dá)水平影響

槲皮素對p-Akt表達(dá)水平影響見圖1。加藥組p-Akt相對表達(dá)水平（0.57±0.04）明顯低于激動(dòng)劑組p-Akt（0.62±0.02） 及空白對照組 p-Akt（1.03±0.05），三者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。加藥組表達(dá)水平低于激動(dòng)劑組（P=0.016）及空白對照組（P<0.001），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；激動(dòng)劑組表達(dá)水平低于空白對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

圖1 槲皮素對Akt蛋白表達(dá)的影響

2.5 槲皮素對細(xì)胞凋亡的影響

槲皮素對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax及Bcl-2表達(dá)的影響見圖2及表2。三組Bax表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。其中加藥組Bax表達(dá)水平高于激動(dòng)劑組及空白對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。激動(dòng)劑組Bax表達(dá)水平與空白對照組比較，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.674）。三組Bcl-2表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。其中加藥組Bcl-2表達(dá)水平低于激動(dòng)劑組及空白對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。激動(dòng)劑組Bcl-2表達(dá)水平低于空白對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）。

表2 槲皮素對凋亡蛋白表達(dá)的影響（±s）

表2 槲皮素對凋亡蛋白表達(dá)的影響（±s）

images/BZ_68_206_3247_357_3313.pngimages/BZ_68_357_3247_552_3313.pngimages/BZ_68_552_3247_770_3313.pngimages/BZ_68_770_3247_1032_3313.png指標(biāo)Bax加藥組1.33±0.10激動(dòng)劑組0.97±0.04空白對照組0.99±0.08 P值<0.001<0.001

圖2 槲皮素對凋亡蛋白表達(dá)的影響

3 討論

槲皮素又名槲皮黃素，多以甙的形式存在于多種植物的花、葉及果實(shí)當(dāng)中［6］。槲皮素具有多種生物活性，包括抗炎、抗病毒、抗細(xì)胞氧化、抗腫瘤增殖等，其中抗腫瘤作用成為近年來研究熱點(diǎn)［7］。國內(nèi)外多種研究表明，槲皮素可通過抑制細(xì)胞信號通路，下調(diào)癌基因表達(dá)，干擾細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等多種途徑發(fā)揮作用［8］。證實(shí)其在體外環(huán)境下能夠抑制胃癌、腸癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖［9］。本研究通過將槲皮素作用于軟骨肉瘤細(xì)胞，證實(shí)其在體外可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路降低細(xì)胞內(nèi)線粒體功能，加速細(xì)胞凋亡。

線粒體是產(chǎn)生ROS的重要細(xì)胞器，當(dāng)其代謝功能出現(xiàn)障礙時(shí)，細(xì)胞供能減少，線粒體內(nèi)ROS、細(xì)胞色素c等物質(zhì)釋放進(jìn)入胞漿，啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡［10］。本研究中采用JC-1檢測線粒體ΔΨm水平，由結(jié)果可見，加藥組ΔΨm明顯降低，說明槲皮素能夠降低線粒體膜電位。當(dāng)ΔΨm降低時(shí)，電子傳遞鏈的傳遞效率減慢，電子從呼吸鏈逸出，與線粒體內(nèi)氧分子結(jié)合產(chǎn)生大量ROS，同時(shí)復(fù)合體V不能依靠質(zhì)子回流合成ATP，出現(xiàn)細(xì)胞供能減少。聚集的ROS導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放，胞漿內(nèi)水進(jìn)入線粒，造成線粒體腫脹破潰，ROS進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。Bax與Bcl-2是一對凋亡相關(guān)蛋白，Bax具有促凋亡作用，Bcl-2具有抗凋亡作用［11］。本研究加藥組Bax表達(dá)增高，Bcl-2表達(dá)降低，說明槲皮素能夠通過改變線粒體功能進(jìn)而加速軟骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的作用。

為進(jìn)一步探討槲皮素對線粒體功能影響的作用機(jī)制，本研究分析了PI3K-Akt這一重要線粒體調(diào)節(jié)通路。PI3K是一種廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的磷脂酰肌醇激酶，兼具有磷脂酰肌醇激酶和絲/蘇氨酸激酶活性，當(dāng)其受到上游酪氨酸激酶的信號激活后使Akt絲/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)磷酸化，形成激活態(tài)的p-Akt［12］。p-Akt進(jìn)一步激活下游雷帕霉素靶蛋白mTOR，從而調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。由本研究結(jié)果分析槲皮素抑制了Akt磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能下降，ΔΨm減低，ROS增多，從而啟動(dòng)線粒體凋亡程序。而加入Akt激動(dòng)劑后，線粒體功能明顯改善，ΔΨm增高，ROS減少，說明槲皮素通過抑制PI3K/Akt抑制線粒體的功能，進(jìn)而誘導(dǎo)軟骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。然而，由于細(xì)胞通路存在交互作用，槲皮素可能存在作用于其他的靶蛋白，或通過Wnt/β-catenin、MAPK/ERK1/2等其他信號通路發(fā)揮作用［13，14］，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，槲皮素能夠通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路，降低軟骨肉瘤細(xì)胞線粒體的生理功能，啟動(dòng)線粒體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡程序，從而達(dá)到抑制軟骨肉瘤細(xì)胞增殖的作用。