周 旭，丁 悅，王明飛，劉鋮祎，蔡 葉

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062）

腰椎間盤突出癥是脊柱外科臨床中非常常見的一類退變性疾病，是引起腰腿痛的常見原因；癥狀嚴重者可導(dǎo)致下肢功能障礙，甚至癱瘓；給社會造成巨大的經(jīng)濟負擔(dān)［1-2］。好發(fā)年齡在20～50歲、病因主要為與年齡有關(guān)的退行性變［3-4］。染色質(zhì)結(jié)合蛋白（chro?mobox protein homolog 8,CBX8）屬于 polycomb group（PcG）蛋白家族，其家族成員參與了調(diào)控細胞增殖分化；控制基因表達的穩(wěn)定［5-7］，甚至失衡導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生［8-9］。現(xiàn)有報道脊柱退行性疾病的發(fā)生與細胞DNA的損傷有一定的關(guān)聯(lián)［10］，而CBX8作為PcG蛋白家族成員參與了DNA損傷修復(fù)。然而CBX8在小鼠椎間盤髓核細胞的體內(nèi)表達以及功能還未知，因此本研究制備CBX8小鼠的針刺椎間盤退行性疾病模型，分別于針刺后8、12、16周進行檢測，觀察小鼠脊柱的穩(wěn)定性、椎間隙高度、髓核細胞的衰老以及炎癥介質(zhì)的表達情況，評估椎間盤退變程度以及CBX8與小鼠椎間盤退變的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料儀器

SPF級C57BL/6小鼠，18～20 g，雄性31只。主要實驗試劑：Tris-SDS分離膠緩沖液（pH8.8），Tris-SDS濃縮膠緩沖液（pH6.8），PMSF，ECL-化學(xué)發(fā)光液，15-150KDa雙色預(yù)染maker，BSA，RIPA裂解液（強）等。主要儀器：恒溫搖床，化學(xué)發(fā)光儀，磁力攪拌器，勻漿器，低溫高速冷凍離心機，電轉(zhuǎn)儀，垂直電泳儀，酶標(biāo)儀等。

1.2 體外實驗

1.2.1 體外髓核細胞分離與培養(yǎng)

取3只小鼠，雌雄不限。以0.5%戊巴比妥鈉0.1mg/kg體重腹腔注射，麻醉后采用心臟采血方法處死，后立即浸泡于75%乙醇30 min，消毒皮膚后放置超凈臺中解剖。鋪無菌手術(shù)巾，取后正中切口，取出整個腰椎，尖刀切開纖維環(huán),將髓核完整取出并剪碎至約1 mm3，隨即放入0.25%的胰蛋白酶液中37℃下消化25 min。消化后使用離心機低速離心8 min（1 200 r/min），吸取上清液后反復(fù)洗滌3次，再將組織放入Ⅱ型膠原酶（含15%胎牛血清）中攪拌消化3 h。離心去除上清液；加入含15%胎牛血清的培養(yǎng)液后，清洗離心，去除上清液，重復(fù)3次；最后吹打細胞并且鏡下記數(shù)，按5×104/ml的密度種植髓核細胞于培養(yǎng)瓶中，并且放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基選擇DMEM F-12（含15%的胎牛血清）。細胞融合為單層時用胰蛋白酶消化后進行細胞傳代培養(yǎng)。

1.2.2 體外髓核細胞鑒定

采用免疫組織化學(xué)檢測鑒定:細胞爬片PBS沖洗2 min，4%多聚甲醛固定30 min，加3%H2O2室溫孵育10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。PBS洗3次，滴加羊抗鼠Ⅱ型膠原多克隆抗體（1∶200），4度冰箱孵育過夜，PBS洗3次，滴加生物素標(biāo)記二抗驢抗羊IgG多克隆抗體 （1∶500），37℃孵育 30 min，PBS洗3次，DAB顯色10 min，PBS沖洗，蘇木素復(fù)染1 min，中性樹脂封片后光鏡下觀察，鑒定原代培養(yǎng)的細胞為髓核細胞。

1.3 體內(nèi)實驗

1.3.1 動物分組與處理

將小鼠隨機分成三組，具體分組如下：正常對照組8只，假手術(shù)組8只，模型組12只。正常對照未給予手術(shù)處理；假手術(shù)組僅行手術(shù)顯露，未損傷椎間盤；模型組小鼠采用穿刺法構(gòu)建椎間盤退變模型，方法如下：

小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉，劑量為50 mg/kg；麻醉成功后，無菌鋪單，常規(guī)碘酒酒精消毒術(shù)區(qū)3遍，縱行依次切開小鼠尾部皮膚、皮下、分離肌肉及結(jié)締組織，暴露腰椎椎間盤；使用31G穿刺針刺入椎間盤1 mm，時間約60 s（針斜面剛好完全進入椎體）造成椎間盤退變。

1.3.2 動物觀察

小鼠蘇醒后半小時放回籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)，術(shù)后1～3 d密切觀察小鼠全身狀況、傷口愈合及四肢活動能力；之后每周觀察兩次小鼠精神狀況、活動能力、體重、毛發(fā)等。

定時稱體重。于建模8、12、16周三個時間點，每個時間點每組處死3只小鼠，解剖脊柱，測量小鼠椎體高度以及椎間盤高度，重復(fù)3次后取平均值，計算椎間盤高度指數(shù)（disc height index,DHI）。觀察小鼠脊柱的穩(wěn)定性、椎間隙高度等情況，評估椎體及椎間盤退變程度。

1.3.3 Westblot檢測

對動物模型，相應(yīng)時間點處死動物，取椎間盤組織。BCA法制備組織裂解液，采用SDS-PAGE凝膠電泳免疫印跡（轉(zhuǎn)膜）及免疫顯色，分別檢測蛋白多糖、II型膠原和CBX8的含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用x2檢驗；計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用單因素方差檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外實驗

2.1.1 免疫組織化學(xué)鑒定

通過Ⅱ型膠原免疫組化染色來鑒定小鼠的原代髓核細胞見圖1。可見胞漿里有黃褐色顆粒沉著，并且核周區(qū)較多，使用蘇木素復(fù)染后髓核區(qū)為藍色，證實為髓核細胞。

圖1 髓核細胞Ⅱ型膠原免疫組化染色（×200）?？梢姲麧{里有黃褐色顆粒沉著，并且核周區(qū)較多，使用蘇木素復(fù)染后髓核區(qū)為藍色，證實為髓核細胞

2.1.2 RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR檢測髓核細胞中蛋白多糖，II型膠原和CBX8的mRNA相對表達量結(jié)果見表1。與原代髓核細胞相比，第5代髓核的II型膠原蛋白mRNA幾乎不表達（P<0.05），蛋白多糖的mRNA表達也顯著下降（P<0.05），但是CBX8的mRNA表達水平卻顯著增加（P<0.05）。

表1 RT-PCR檢測原代與第5代髓核細胞mRNA相對表達結(jié)果 （±s） 與比較

表1 RT-PCR檢測原代與第5代髓核細胞mRNA相對表達結(jié)果 （±s） 與比較

蛋白多糖CBX8images/BZ_63_945_2404_1180_2470.pngimages/BZ_63_204_2537_379_2603.pngimages/BZ_63_379_2537_630_2603.png1.00±0.00 1.00±0.00images/BZ_63_630_2537_945_2603.png0.23±0.02 1.68±0.26images/BZ_63_945_2537_1180_2603.png<0.001 0.010

2.2 體內(nèi)實驗

造模手術(shù)后三組小鼠活動能力、體重、毛發(fā)等無明顯差異。三組小鼠體重測量結(jié)果見圖2，顯示三組動物小鼠體重隨時間變化而改變，相應(yīng)時間點，三組動物體重的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖2 三組小鼠不同時間點體重的變化。三組動物小鼠體重隨時間變化而改變，相應(yīng)時間點，三組動物體重的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）

大體標(biāo)本觀察見圖3，正常對照組及假手術(shù)組及正常對照組的椎體高度無明顯變化，椎體無側(cè)位退變的發(fā)生。模型組的椎體發(fā)生一定程度的退變性側(cè)彎，椎體的高度也明顯下降。

圖3 三組小鼠脊柱標(biāo)本大體觀察左：正常對照組；中：模型組；右：假手術(shù)組。正常對照組及假手術(shù)組及正常對照組的椎體高度無明顯變化，椎體無側(cè)位退變的發(fā)生。模型組的椎體發(fā)生一定程度的退變性側(cè)彎，椎體的高度也明顯下降

三組II型膠原和CBX8相對含量的westblot檢測結(jié)果見表2。隨時間推移，三組動物的II膠原蛋白含量均呈下降趨勢（P<0.05），其中模型組的下降最為明顯。相應(yīng)時間點，模型組的II型膠原蛋白含量均明顯低于正常組及假手術(shù)組（P<0.05）。隨時間推移，正常組CBX8的含量持續(xù)下降（P<0.05），而假手術(shù)組術(shù)后12周CBX8達峰值，爾后下降，不同時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。相應(yīng)時間點，模型組CBX8的含量均顯著高于正常對照組和假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

表2 West blot檢測三組動物II型膠原蛋白和CBX8蛋白相對表達結(jié)果（±s）與比較

表2 West blot檢測三組動物II型膠原蛋白和CBX8蛋白相對表達結(jié)果（±s）與比較

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3 討論

椎間盤由外圍的纖維環(huán)和中心的髓核組成；髓核又是由軟骨細胞和蛋白多糖黏液樣基質(zhì)構(gòu)成的彈性膠凍物質(zhì)；髓核合成分解的平衡失調(diào)導(dǎo)致了椎間盤的退變發(fā)生及平衡失調(diào)。因此活化髓核細胞，改善細胞外環(huán)境，有可能延緩甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤組織退變進程的發(fā)生及發(fā)展［11-14］。所以髓核細胞生物學(xué)活性的維持甚至加強，現(xiàn)在已經(jīng)成為研究脊柱退行性疾病的重點和熱點。

Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖是正常髓核的重要表型特征，絲狀的膠原蛋白纖維、彈性蛋白以及蛋白多糖融合后形成的網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，能夠產(chǎn)生一定的生物學(xué)強度；其在活體髓核細胞中具有營養(yǎng)供給、維持滲透壓和髓核細胞形態(tài)的作用，椎間盤退變過程中，Ⅱ型膠原蛋白含量降低，也能夠間接反映髓核細胞的增殖和活力情況［15］。本實驗中髓核細胞通過多次培養(yǎng)傳代，在第3代后即出現(xiàn)生長緩慢，功能逐漸喪失的表象，同時檢測傳代后的細胞中細胞成分變化，發(fā)現(xiàn)II型膠原及蛋白多糖的表達逐漸減少，CBX8表達增加，說明CBX8參與了髓核細胞的退變進程。Maertens等［16］也發(fā)現(xiàn)CBX8的表達能夠在一定程度上有著延緩成纖維細胞衰老的作用。

本實驗中模型組的細胞II型膠原含量明顯低于假手術(shù)組和正常組，CBX8的含量卻明顯增加，說明CBX8與髓核細胞的退變密切相關(guān)且有著一定的維持髓核細胞增殖能力。Dietrich等［17］發(fā)現(xiàn)CBX8具有促進成纖維細胞的生長的能力，并且是通過INK4AARF通路來進行。

腰椎間盤突出癥是脊柱外科臨床中非常常見的一種退變性疾病。椎間盤的退變其實從青中年就已經(jīng)開始，引發(fā)甚至加速退變的主要因素就是髓核的變性。所有脊柱疾病的發(fā)生主要由內(nèi)外兩個因素導(dǎo)致，內(nèi)在因素主要是脊柱整體的退變，導(dǎo)致椎體失穩(wěn)，外在因素主要是外傷、勞損、環(huán)境變化等因素。目前引起椎間盤退變的明確分子機制尚沒有明確的結(jié)論，但研究發(fā)現(xiàn)退變的發(fā)生與椎間盤中的各種細胞生物分子因素相關(guān)。

臨床上治療椎間盤退變最理想的方法是在分子層面早期的人為干預(yù)，保持其生物學(xué)特性及功能。生物基因治療是目前腰椎退行性變系列疾病治療的新的方法，這種方法主要是針對髓核細胞退變的內(nèi)在活性及分子成分，通過基因分子層面中調(diào)控基因的表達來糾正退變椎間盤細胞中功能方面的缺陷，從而延緩或阻止，甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤退變進程。本實驗發(fā)現(xiàn)PcG蛋白家族中的CBX8在小鼠退變模型中表達隨著退變的發(fā)展逐漸增加，提示CBX8可能在髓核細胞的衰老退變進程中發(fā)揮重要的作用，這也許就為將來的基因治療提供了一個新的靶點。本研究的不足之處為：造模的小鼠和人類的自然退變模式不符，另分子通路相關(guān)的研究未得到進一步證實；相信隨著科學(xué)的進步，相似性更高的動物模型會進一步闡明椎間盤退變的分子機制。