李云，蘇鈦，李瑪，熊永興，，邱斌，，3*

1.云南白藥集團中藥資源有限公司，云南 昆明 650500；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；3.云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500

滇黃精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.首載于《滇南本草》，為百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatum)多年生草本植物，主要分布于我國云南、四川和貴州，越南、緬甸也有分布[1]。其以干燥根莖入藥，收載于歷版《中華人民共和國藥典》，是云南省重要的道地藥材之一，具補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎之功效，用于脾胃氣虛、體倦乏力、胃陰不足、口干食少等[2]。目前，滇黃精藥材主要來源于野生，由于過度采挖，資源已近枯竭。滇黃精繁殖方式分為有性和無性2種，早期生產(chǎn)栽培上主要采用塊莖無性繁殖的方式，出苗率低且種苗整齊度差，其產(chǎn)量和質(zhì)量已不能滿足市場需求。采用有性繁殖時，因滇黃精種子胚后熟且具有休眠特性，自然條件下30 d萌發(fā)率僅為32%，60 d萌發(fā)率不足80%，整齊度低，對規(guī)范化種植造成了較大影響[3]。因此，建立滇黃精種子質(zhì)量標準檢驗方法，保證種子質(zhì)量，對人工規(guī)?；?、標準化種植具有重要意義。

目前，滇黃精的研究主要集中在資源、化學、藥理等方面[4-11]，關于滇黃精種子檢驗規(guī)程的研究尚屬空白。本研究參照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》GB/T 3543.2—1995，對滇黃精種子真實性鑒定、凈度、千粒質(zhì)量、含水量、發(fā)芽率等主要指標開展了系統(tǒng)的研究，初步建立了滇黃精種子質(zhì)量檢驗方法，為制定滇黃精種子檢驗規(guī)程及質(zhì)量分級標準提供參考。

1 材料

2017年11月于云南省文山、普洱、昭通、曲靖等地采集種子樣品(表1)，經(jīng)云南省藥物研究所中藥材種植研究室邱斌正高級工程師鑒定為滇黃精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.的種子。

表1 滇黃精種子信息

赤霉素(GA3，生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。MGC-450HP型光照培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

2 方法

2.1 扦樣

依據(jù)滇黃精種子市場流通情況和單次可能的交易量，參照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》 GB/T 3543.2—1995扦樣方法執(zhí)行，凈度分析試驗樣品≥200 g，種子及送驗樣品為試驗樣品10倍量。采用徒手減半法分取初次樣品和實驗樣品。

2.2 凈度分析

參照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》GB/T 3543.2—1995凈度分析規(guī)定進行凈度分析。隨機稱取(50.00±0.05) g，5次重復。

2.3 真實性鑒定

采用外觀形態(tài)觀察法和外觀形態(tài)測量法，用肉眼觀察滇黃精種子形態(tài)并對其進行形態(tài)形狀描述；用電子數(shù)顯卡尺(0～150 mm)對其粒長、粒寬(直徑)進行測量，記錄數(shù)據(jù)。隨機選取滇黃精種子樣品50粒，3次重復。

2.4 千粒質(zhì)量測定

取凈選后的種子分別采用百粒法、千粒法測定種子質(zhì)量。

百粒法：隨機從凈種子中數(shù)取100粒，重復6次，分別記錄百粒質(zhì)量，計算標準差及變異系數(shù)，變異系數(shù)<4%則該測定值有效。

千粒法：隨機從凈種子中取1000粒，重復 2次，分別記錄千粒質(zhì)量，計算重復間差數(shù)與平均數(shù)之比，重復間差數(shù)與平均數(shù)之比<5%則該測定值有效。

2.5 含水量測定

取凈選后的種子，參照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》GB/T 3543.6—1995水分測定的規(guī)定，分別采用高溫[(133±2) ℃]恒溫烘干法與低溫[(105±2) ℃]恒溫烘干法進行含水量測定。每份試樣稱取種子樣品5 g，重復3次。低恒溫烘干法要求每隔1 h 測定質(zhì)量；高恒溫烘干法要求每隔30 min測定質(zhì)量，至連續(xù)3次相對偏差<3 mg。

2.6 生活力測定

2.6.1染色溫度和染色時間確定 凈選后隨機選取30粒種子，常溫條件下用蒸餾水浸泡48 h后沿種子胚軸縱切，帶胚的一半放入培養(yǎng)皿進行測試。倒入0.03%TTC溶液，放置于20、25、30、35 ℃的避光恒溫培養(yǎng)箱中，觀察不同時間滇黃精種子樣品的染色情況并記錄。

2.6.2TTC質(zhì)量分數(shù)確定 凈選后隨機選取30粒種子，在常溫條件下用蒸餾水浸泡48 h后沿種子胚軸縱切，帶胚的一半放入培養(yǎng)皿進行測試。倒入0.01%、0.03%、0.05%、0.07%TCC溶液浸濕，放置于避光恒溫培養(yǎng)箱中，溫度設定為2.6.1項下確定的最佳溫度，觀察經(jīng)過不同質(zhì)量分數(shù)TTC溶液處理的滇黃精種子樣品染色情況并記錄。

2.6.3有無生活力鑒定標準的確定 觀察滇黃精種子有無生活力。有活力的種子胚染色后為鮮紅色或淺紅色，種子切面全部著色或大部分著色，染色均勻；無生活力者，胚完全不著色或著淺色，染色不均勻或局部著色，著色較淺。

2.7 發(fā)芽率測定

2.7.1發(fā)芽前處理 采用以下方法對種子進行前處理：1)層積實驗：滇黃精種子于4 ℃下濕砂層積60 d；2)外源激素實驗：150 mg·L-1GA3浸種24 h；3)層積+外源激素實驗：滇黃精層積60 d 后，再用150 mg·L-1GA3浸種24 h；4)CK：未經(jīng)任何處理的種子直接用于發(fā)芽實驗。用雙層濾紙作發(fā)芽床，25 ℃、黑暗條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個處理100粒種子，3次重復。

2.7.2發(fā)芽床的選擇 設置砂上、紙上和砂間3個處理，培養(yǎng)條件為20 ℃黑暗培養(yǎng)，每個處理100粒種子，3次重復，觀察統(tǒng)計種子發(fā)芽情況。

2.7.3發(fā)芽溫度和光照的選擇 設置15、20、25、30 ℃ 4個處理，發(fā)芽床為紙上，光照12 h·d-1和黑暗處理。每個處理100粒種子，3次重復，觀察種子發(fā)芽情況。

2.7.4發(fā)芽計數(shù)時間確定 根據(jù)滇黃精種子發(fā)芽表現(xiàn)，明確初次計數(shù)時間和末次計數(shù)時間。初次計數(shù)時間為胚根伸出種皮2 mm，末次計數(shù)時間為種子發(fā)芽數(shù)達到最高時，以后再無發(fā)芽種子出現(xiàn)時的天數(shù)為準。

2.7.5結(jié)果統(tǒng)計 試驗結(jié)果以發(fā)芽率表示，按公式(1)計算發(fā)芽率。

發(fā)芽率=實驗結(jié)束時發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(1)

3 結(jié)果

3.1 扦樣

采用徒手四分法，滇黃精種子的凈度分析實驗所需樣品應≥200 g，送檢樣品應≥2000 g。

3.2 凈度分析

如表2所示，滇黃精種子凈度較高，在97.84%以上，各試樣增失差距均在原始質(zhì)量的5%以內(nèi)，故此方法和程序可行。

表2 滇黃精種子凈度

3.3 真實性鑒定

滇黃精種子呈橢圓球形，新鮮滇黃精種子表面淡黃白色，微扁狀，表面光澤，質(zhì)硬。干燥后種子呈黃褐色，種子堅硬，種臍明顯，呈深褐色，圓點狀。整個種子種皮1層，粒長4.69～7.40 mm，粒寬3.23～5.43 mm。

3.4 千粒質(zhì)量

百粒法測定的滇黃精種子的變異系數(shù)為2.6%，小于標準值4.0%，因此測定值有效；千粒法測定滇黃精種子之后的重復間差數(shù)與平均數(shù)之比為4.1%，小于標準值5.0%，因此測定值有效(表3)。綜合比較2種方法，百粒法所需種子量少，故確定百粒法為滇黃精種子質(zhì)量測定方法，千粒質(zhì)量為83.3～85.3 g。

表3 滇黃精種子質(zhì)量測定結(jié)果

3.5 含水量測定

采用高恒溫烘干法[(133±2) ℃]測定滇黃精種子樣品的含水量，滇黃精種子在烘干過程中前4 h內(nèi)失水迅速，之后的幾個小時失水緩慢。7 h后接近恒重，種子的含水量也逐漸趨于穩(wěn)定，3次測量后的相對偏差在3 mg以下。采用低恒溫烘干法[(102±2) ℃]測定滇黃精種子樣品的含水量可知，種子在烘干過程中前8 h內(nèi)失水迅速，至11 h后接近恒重，種子的含水量也逐漸趨于穩(wěn)定。2種方法相比較，高恒溫烘干法比較節(jié)約時間，故選用高恒溫烘干法烘干7 h 測定滇黃精種子含水量。滇黃精種子含水量為34.8%～35.9%。

3.6 生活力測定

3.6.1染色溫度和染色時間確定 不同溫度、時間對滇黃精染色影響較大，在同一溫度下，染色率與時間成正比；在同一染色時間里，染色率隨著溫度的上升逐漸升高，在35 ℃達到頂峰，而后出現(xiàn)下降趨勢。在同一染色溫度下，24 h內(nèi)染色率與時間成正比，24 h以后無明顯上升趨勢(表4)。故滇黃精的適宜染色溫度為35 ℃，染色時間為24 h。

表4 染色溫度和時間對滇黃精種子生活力的影響

3.6.2TTC質(zhì)量分數(shù)確定 TTC質(zhì)量分數(shù)為0.01%～0.07%時，染色率呈先上升而后逐漸下降趨勢(表5)。在質(zhì)量分數(shù)為0.03%時，滇黃精種子生活力測定值最高。因此，TTC染色法測定滇黃精種子的生活力最適宜質(zhì)量分數(shù)為0.03%。該條件下測定DHJ-1、DHJ-2、DHJ-3、DHJ-4、DHJ-5的生活力分別是98.6%、96.7%、99.2%、95.9%、96.3%。

表5 TTC質(zhì)量分數(shù)對滇黃精種子染色率的影響

3.7 發(fā)芽率測定

3.7.1發(fā)芽前處理 以鹽津縣牛寨鄉(xiāng)的滇黃精種子為實驗對象。滇黃精種子經(jīng)層積處理后能明顯減少發(fā)芽時間數(shù)，提高發(fā)芽率和發(fā)芽勢(表6)。層積處理后，時間從CK 處理的21 d減少至12 d，發(fā)芽勢從25.8%提升至5.6%。GA3處理與CK 無明顯區(qū)別。層積+GA3 處理能大幅減少發(fā)芽天數(shù)，6 d便能萌發(fā)，發(fā)芽勢與層積處理無明顯差別。故萌發(fā)前處理優(yōu)勢為層積+GA3>層積>CK>GA3。滇黃精種子萌發(fā)前處理宜用層積60 d 后，用150 mg·L-1的GA3浸泡24 h。

表6 前處理對滇黃精種子萌發(fā)的影響

3.7.2發(fā)芽床的選擇 發(fā)芽床對滇黃精的發(fā)芽影響較小。紙上和砂上發(fā)芽率大致相當，略高于砂間(表7)。故滇黃精種子適宜的發(fā)芽床為紙上和砂上，鑒于實驗操作的便捷，選擇紙上作為發(fā)芽床。

表7 不同發(fā)芽床滇黃精種子發(fā)芽率

3.7.3發(fā)芽溫度和光照的選擇 滇黃精種子的萌發(fā)隨著溫度的提高出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(表8)。在15～25 ℃，滇黃精種子萌發(fā)率逐漸上升，30 ℃后明顯下降。光照對滇黃精種子萌發(fā)影響顯著。黑暗條件下明顯高于12 h 光照。故滇黃精種子適宜萌發(fā)條件為溫度為20～25 ℃，避光環(huán)境下。

表8 不同溫度和光照下滇黃精種子發(fā)芽率

3.7.4發(fā)芽計數(shù)時間的確定 種子置發(fā)芽床后第六天胚根突破種皮約2 mm，以后種子逐漸發(fā)芽，27 d后，發(fā)芽基本結(jié)束。因此，滇黃精種子初次計數(shù)時間為第六天，末次計數(shù)時間為第二十七天。

3.8 滇黃精種子檢驗規(guī)程的制定

參照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》，從扦樣、凈度分析、真實性鑒定、質(zhì)量測定、發(fā)芽條件探索、含水量及生活力測定7個方面進行滇黃精種子質(zhì)量檢驗方法進行系統(tǒng)研究，初步確定適宜滇黃精種子質(zhì)量指標的檢驗方法(表9)。

表9 滇黃精種子質(zhì)量檢驗方法

4 討論

中藥材種子質(zhì)量研究起步晚，其研究以農(nóng)作物種子檢驗為圭臬，對市場流通的中藥材種子無法有效控制。隨著醫(yī)藥現(xiàn)代化的進程，三七、人參[12]等已走出國門，發(fā)布了種子國際標準，對中藥材種子市場的規(guī)范起到了引領作用。種子作為藥材質(zhì)量的源頭，是決定藥材品質(zhì)的關鍵因素，種子質(zhì)量研究為藥材質(zhì)量的第一道關卡。本研究參照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》，從扦樣、凈度分析、真實性鑒定、千粒質(zhì)量、含水量、發(fā)芽及生活力7個方面對滇黃精種子質(zhì)量檢驗方法進行研究，初步確定了適宜滇黃精種子質(zhì)量指標的檢驗方法。

滇黃精系云南道地藥材，分布區(qū)域較廣。本研究針對云南“一山分四季，十里不同天”的低緯高原地域特性，從滇黃精主要分布區(qū)域，選取5個主產(chǎn)區(qū)作為代表，能較好地反映生產(chǎn)用種質(zhì)量。

黃精種子具有休眠特性[13-14]，采用低溫層積和激素處理可以打破休眠，提前萌發(fā)。本研究所用種子為新鮮種子(新鮮果實經(jīng)塑料袋密封20 d后，搓去種皮)，通過層積60 d和GA3浸泡24 h可促進胚的后熟，解除胚的休眠，縮短發(fā)芽天數(shù)，提高發(fā)芽率和發(fā)芽勢。