李云，蘇鈦，李瑪，熊永興，，邱斌，，3*

1.云南白藥集團(tuán)中藥資源有限公司，云南 昆明 650500；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；3.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500

滇黃精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.首載于《滇南本草》，為百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatum)多年生草本植物，主要分布于我國(guó)云南、四川和貴州，越南、緬甸也有分布[1]。其以干燥根莖入藥，收載于歷版《中華人民共和國(guó)藥典》，是云南省重要的道地藥材之一，具補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎之功效，用于脾胃氣虛、體倦乏力、胃陰不足、口干食少等[2]。目前，滇黃精藥材主要來(lái)源于野生，由于過(guò)度采挖，資源已近枯竭。滇黃精繁殖方式分為有性和無(wú)性2種，早期生產(chǎn)栽培上主要采用塊莖無(wú)性繁殖的方式，出苗率低且種苗整齊度差，其產(chǎn)量和質(zhì)量已不能滿足市場(chǎng)需求。采用有性繁殖時(shí)，因滇黃精種子胚后熟且具有休眠特性，自然條件下30 d萌發(fā)率僅為32%，60 d萌發(fā)率不足80%，整齊度低，對(duì)規(guī)范化種植造成了較大影響[3]。因此，建立滇黃精種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，保證種子質(zhì)量，對(duì)人工規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化種植具有重要意義。

目前，滇黃精的研究主要集中在資源、化學(xué)、藥理等方面[4-11]，關(guān)于滇黃精種子檢驗(yàn)規(guī)程的研究尚屬空白。本研究參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》GB/T 3543.2—1995，對(duì)滇黃精種子真實(shí)性鑒定、凈度、千粒質(zhì)量、含水量、發(fā)芽率等主要指標(biāo)開(kāi)展了系統(tǒng)的研究，初步建立了滇黃精種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法，為制定滇黃精種子檢驗(yàn)規(guī)程及質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

2017年11月于云南省文山、普洱、昭通、曲靖等地采集種子樣品(表1)，經(jīng)云南省藥物研究所中藥材種植研究室邱斌正高級(jí)工程師鑒定為滇黃精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.的種子。

表1 滇黃精種子信息

赤霉素(GA3，生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。MGC-450HP型光照培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 扦樣

依據(jù)滇黃精種子市場(chǎng)流通情況和單次可能的交易量，參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》 GB/T 3543.2—1995扦樣方法執(zhí)行，凈度分析試驗(yàn)樣品≥200 g，種子及送驗(yàn)樣品為試驗(yàn)樣品10倍量。采用徒手減半法分取初次樣品和實(shí)驗(yàn)樣品。

2.2 凈度分析

參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》GB/T 3543.2—1995凈度分析規(guī)定進(jìn)行凈度分析。隨機(jī)稱取(50.00±0.05) g，5次重復(fù)。

2.3 真實(shí)性鑒定

采用外觀形態(tài)觀察法和外觀形態(tài)測(cè)量法，用肉眼觀察滇黃精種子形態(tài)并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)形狀描述；用電子數(shù)顯卡尺(0～150 mm)對(duì)其粒長(zhǎng)、粒寬(直徑)進(jìn)行測(cè)量，記錄數(shù)據(jù)。隨機(jī)選取滇黃精種子樣品50粒，3次重復(fù)。

2.4 千粒質(zhì)量測(cè)定

取凈選后的種子分別采用百粒法、千粒法測(cè)定種子質(zhì)量。

百粒法：隨機(jī)從凈種子中數(shù)取100粒，重復(fù)6次，分別記錄百粒質(zhì)量，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)，變異系數(shù)<4%則該測(cè)定值有效。

千粒法：隨機(jī)從凈種子中取1000粒，重復(fù) 2次，分別記錄千粒質(zhì)量，計(jì)算重復(fù)間差數(shù)與平均數(shù)之比，重復(fù)間差數(shù)與平均數(shù)之比<5%則該測(cè)定值有效。

2.5 含水量測(cè)定

取凈選后的種子，參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》GB/T 3543.6—1995水分測(cè)定的規(guī)定，分別采用高溫[(133±2) ℃]恒溫烘干法與低溫[(105±2) ℃]恒溫烘干法進(jìn)行含水量測(cè)定。每份試樣稱取種子樣品5 g，重復(fù)3次。低恒溫烘干法要求每隔1 h 測(cè)定質(zhì)量；高恒溫烘干法要求每隔30 min測(cè)定質(zhì)量，至連續(xù)3次相對(duì)偏差<3 mg。

2.6 生活力測(cè)定

2.6.1染色溫度和染色時(shí)間確定 凈選后隨機(jī)選取30粒種子，常溫條件下用蒸餾水浸泡48 h后沿種子胚軸縱切，帶胚的一半放入培養(yǎng)皿進(jìn)行測(cè)試。倒入0.03%TTC溶液，放置于20、25、30、35 ℃的避光恒溫培養(yǎng)箱中，觀察不同時(shí)間滇黃精種子樣品的染色情況并記錄。

2.6.2TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定 凈選后隨機(jī)選取30粒種子，在常溫條件下用蒸餾水浸泡48 h后沿種子胚軸縱切，帶胚的一半放入培養(yǎng)皿進(jìn)行測(cè)試。倒入0.01%、0.03%、0.05%、0.07%TCC溶液浸濕，放置于避光恒溫培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定為2.6.1項(xiàng)下確定的最佳溫度，觀察經(jīng)過(guò)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)TTC溶液處理的滇黃精種子樣品染色情況并記錄。

2.6.3有無(wú)生活力鑒定標(biāo)準(zhǔn)的確定 觀察滇黃精種子有無(wú)生活力。有活力的種子胚染色后為鮮紅色或淺紅色，種子切面全部著色或大部分著色，染色均勻；無(wú)生活力者，胚完全不著色或著淺色，染色不均勻或局部著色，著色較淺。

2.7 發(fā)芽率測(cè)定

2.7.1發(fā)芽前處理 采用以下方法對(duì)種子進(jìn)行前處理：1)層積實(shí)驗(yàn)：滇黃精種子于4 ℃下濕砂層積60 d；2)外源激素實(shí)驗(yàn)：150 mg·L-1GA3浸種24 h；3)層積+外源激素實(shí)驗(yàn)：滇黃精層積60 d 后，再用150 mg·L-1GA3浸種24 h；4)CK：未經(jīng)任何處理的種子直接用于發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。用雙層濾紙作發(fā)芽床，25 ℃、黑暗條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理100粒種子，3次重復(fù)。

2.7.2發(fā)芽床的選擇 設(shè)置砂上、紙上和砂間3個(gè)處理，培養(yǎng)條件為20 ℃黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理100粒種子，3次重復(fù)，觀察統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽情況。

2.7.3發(fā)芽溫度和光照的選擇 設(shè)置15、20、25、30 ℃ 4個(gè)處理，發(fā)芽床為紙上，光照12 h·d-1和黑暗處理。每個(gè)處理100粒種子，3次重復(fù)，觀察種子發(fā)芽情況。

2.7.4發(fā)芽計(jì)數(shù)時(shí)間確定 根據(jù)滇黃精種子發(fā)芽表現(xiàn)，明確初次計(jì)數(shù)時(shí)間和末次計(jì)數(shù)時(shí)間。初次計(jì)數(shù)時(shí)間為胚根伸出種皮2 mm，末次計(jì)數(shù)時(shí)間為種子發(fā)芽數(shù)達(dá)到最高時(shí)，以后再無(wú)發(fā)芽種子出現(xiàn)時(shí)的天數(shù)為準(zhǔn)。

2.7.5結(jié)果統(tǒng)計(jì) 試驗(yàn)結(jié)果以發(fā)芽率表示，按公式(1)計(jì)算發(fā)芽率。

發(fā)芽率=實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(1)

3 結(jié)果

3.1 扦樣

采用徒手四分法，滇黃精種子的凈度分析實(shí)驗(yàn)所需樣品應(yīng)≥200 g，送檢樣品應(yīng)≥2000 g。

3.2 凈度分析

如表2所示，滇黃精種子凈度較高，在97.84%以上，各試樣增失差距均在原始質(zhì)量的5%以內(nèi)，故此方法和程序可行。

表2 滇黃精種子凈度

3.3 真實(shí)性鑒定

滇黃精種子呈橢圓球形，新鮮滇黃精種子表面淡黃白色，微扁狀，表面光澤，質(zhì)硬。干燥后種子呈黃褐色，種子堅(jiān)硬，種臍明顯，呈深褐色，圓點(diǎn)狀。整個(gè)種子種皮1層，粒長(zhǎng)4.69～7.40 mm，粒寬3.23～5.43 mm。

3.4 千粒質(zhì)量

百粒法測(cè)定的滇黃精種子的變異系數(shù)為2.6%，小于標(biāo)準(zhǔn)值4.0%，因此測(cè)定值有效；千粒法測(cè)定滇黃精種子之后的重復(fù)間差數(shù)與平均數(shù)之比為4.1%，小于標(biāo)準(zhǔn)值5.0%，因此測(cè)定值有效(表3)。綜合比較2種方法，百粒法所需種子量少，故確定百粒法為滇黃精種子質(zhì)量測(cè)定方法，千粒質(zhì)量為83.3～85.3 g。

表3 滇黃精種子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

3.5 含水量測(cè)定

采用高恒溫烘干法[(133±2) ℃]測(cè)定滇黃精種子樣品的含水量，滇黃精種子在烘干過(guò)程中前4 h內(nèi)失水迅速，之后的幾個(gè)小時(shí)失水緩慢。7 h后接近恒重，種子的含水量也逐漸趨于穩(wěn)定，3次測(cè)量后的相對(duì)偏差在3 mg以下。采用低恒溫烘干法[(102±2) ℃]測(cè)定滇黃精種子樣品的含水量可知，種子在烘干過(guò)程中前8 h內(nèi)失水迅速，至11 h后接近恒重，種子的含水量也逐漸趨于穩(wěn)定。2種方法相比較，高恒溫烘干法比較節(jié)約時(shí)間，故選用高恒溫烘干法烘干7 h 測(cè)定滇黃精種子含水量。滇黃精種子含水量為34.8%～35.9%。

3.6 生活力測(cè)定

3.6.1染色溫度和染色時(shí)間確定 不同溫度、時(shí)間對(duì)滇黃精染色影響較大，在同一溫度下，染色率與時(shí)間成正比；在同一染色時(shí)間里，染色率隨著溫度的上升逐漸升高，在35 ℃達(dá)到頂峰，而后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。在同一染色溫度下，24 h內(nèi)染色率與時(shí)間成正比，24 h以后無(wú)明顯上升趨勢(shì)(表4)。故滇黃精的適宜染色溫度為35 ℃，染色時(shí)間為24 h。

表4 染色溫度和時(shí)間對(duì)滇黃精種子生活力的影響

3.6.2TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定 TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%～0.07%時(shí)，染色率呈先上升而后逐漸下降趨勢(shì)(表5)。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%時(shí)，滇黃精種子生活力測(cè)定值最高。因此，TTC染色法測(cè)定滇黃精種子的生活力最適宜質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%。該條件下測(cè)定DHJ-1、DHJ-2、DHJ-3、DHJ-4、DHJ-5的生活力分別是98.6%、96.7%、99.2%、95.9%、96.3%。

表5 TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)滇黃精種子染色率的影響

3.7 發(fā)芽率測(cè)定

3.7.1發(fā)芽前處理 以鹽津縣牛寨鄉(xiāng)的滇黃精種子為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。滇黃精種子經(jīng)層積處理后能明顯減少發(fā)芽時(shí)間數(shù)，提高發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)(表6)。層積處理后，時(shí)間從CK 處理的21 d減少至12 d，發(fā)芽勢(shì)從25.8%提升至5.6%。GA3處理與CK 無(wú)明顯區(qū)別。層積+GA3 處理能大幅減少發(fā)芽天數(shù)，6 d便能萌發(fā)，發(fā)芽勢(shì)與層積處理無(wú)明顯差別。故萌發(fā)前處理優(yōu)勢(shì)為層積+GA3>層積>CK>GA3。滇黃精種子萌發(fā)前處理宜用層積60 d 后，用150 mg·L-1的GA3浸泡24 h。

表6 前處理對(duì)滇黃精種子萌發(fā)的影響

3.7.2發(fā)芽床的選擇 發(fā)芽床對(duì)滇黃精的發(fā)芽影響較小。紙上和砂上發(fā)芽率大致相當(dāng)，略高于砂間(表7)。故滇黃精種子適宜的發(fā)芽床為紙上和砂上，鑒于實(shí)驗(yàn)操作的便捷，選擇紙上作為發(fā)芽床。

表7 不同發(fā)芽床滇黃精種子發(fā)芽率

3.7.3發(fā)芽溫度和光照的選擇 滇黃精種子的萌發(fā)隨著溫度的提高出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(表8)。在15～25 ℃，滇黃精種子萌發(fā)率逐漸上升，30 ℃后明顯下降。光照對(duì)滇黃精種子萌發(fā)影響顯著。黑暗條件下明顯高于12 h 光照。故滇黃精種子適宜萌發(fā)條件為溫度為20～25 ℃，避光環(huán)境下。

表8 不同溫度和光照下滇黃精種子發(fā)芽率

3.7.4發(fā)芽計(jì)數(shù)時(shí)間的確定 種子置發(fā)芽床后第六天胚根突破種皮約2 mm，以后種子逐漸發(fā)芽，27 d后，發(fā)芽基本結(jié)束。因此，滇黃精種子初次計(jì)數(shù)時(shí)間為第六天，末次計(jì)數(shù)時(shí)間為第二十七天。

3.8 滇黃精種子檢驗(yàn)規(guī)程的制定

參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》，從扦樣、凈度分析、真實(shí)性鑒定、質(zhì)量測(cè)定、發(fā)芽條件探索、含水量及生活力測(cè)定7個(gè)方面進(jìn)行滇黃精種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法進(jìn)行系統(tǒng)研究，初步確定適宜滇黃精種子質(zhì)量指標(biāo)的檢驗(yàn)方法(表9)。

表9 滇黃精種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法

4 討論

中藥材種子質(zhì)量研究起步晚，其研究以農(nóng)作物種子檢驗(yàn)為圭臬，對(duì)市場(chǎng)流通的中藥材種子無(wú)法有效控制。隨著醫(yī)藥現(xiàn)代化的進(jìn)程，三七、人參[12]等已走出國(guó)門，發(fā)布了種子國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)中藥材種子市場(chǎng)的規(guī)范起到了引領(lǐng)作用。種子作為藥材質(zhì)量的源頭，是決定藥材品質(zhì)的關(guān)鍵因素，種子質(zhì)量研究為藥材質(zhì)量的第一道關(guān)卡。本研究參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》，從扦樣、凈度分析、真實(shí)性鑒定、千粒質(zhì)量、含水量、發(fā)芽及生活力7個(gè)方面對(duì)滇黃精種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法進(jìn)行研究，初步確定了適宜滇黃精種子質(zhì)量指標(biāo)的檢驗(yàn)方法。

滇黃精系云南道地藥材，分布區(qū)域較廣。本研究針對(duì)云南“一山分四季，十里不同天”的低緯高原地域特性，從滇黃精主要分布區(qū)域，選取5個(gè)主產(chǎn)區(qū)作為代表，能較好地反映生產(chǎn)用種質(zhì)量。

黃精種子具有休眠特性[13-14]，采用低溫層積和激素處理可以打破休眠，提前萌發(fā)。本研究所用種子為新鮮種子(新鮮果實(shí)經(jīng)塑料袋密封20 d后，搓去種皮)，通過(guò)層積60 d和GA3浸泡24 h可促進(jìn)胚的后熟，解除胚的休眠，縮短發(fā)芽天數(shù)，提高發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。