農(nóng)璐琪,劉自強(qiáng),韓夢(mèng)雨,訾迎新,鄧宇,孟歡,金明
1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029;2.北京中日友好醫(yī)院 眼科,北京 100029
干眼是近年來(lái)眼科門診常見疾病之一,是指任何原因?qū)е碌臏I液的質(zhì)、量或流體動(dòng)力學(xué)異常造成的以眼睛干澀、燒灼感等眼部不適癥狀為主要臨床表現(xiàn)的疾病,中醫(yī)歸屬于白澀癥、神水將枯范疇,滋陰為其主要治療原則。魚腥草滴眼液是臨床眼科門診常用中藥滴眼液之一,主要用于治療急慢性角結(jié)膜炎等炎性眼表疾病。其主要組成為三白草科蕺菜的新鮮全草[1],即魚腥草,具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋等作用;藥理學(xué)研究證實(shí)魚腥草具有抗炎、抗病毒、抗菌等作用[2]。近年亦有采用魚腥草滴眼液治療干眼的研究[3],收效甚佳?;诟裳叟c炎癥相關(guān)的發(fā)病機(jī)制,推測(cè)魚腥草滴眼液治療干眼與抗炎有關(guān),但其治療干眼的作用機(jī)制尚不明確。
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年新興的用于研究中藥活性成分和作用靶點(diǎn)的新策略[4],能夠從多方面闡釋藥物治療疾病的潛在作用機(jī)制,體現(xiàn)藥物作用的整體性和系統(tǒng)性[5]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,構(gòu)建魚腥草-干眼的活性成分及作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),以期明確魚腥草治療干眼的作用機(jī)制,為臨床治療提供參考。
利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://tcmspw. com/tcmsp.php)檢索滴眼液主要組分魚腥草中含有的有效成分,根據(jù)化合物類藥性規(guī)則并結(jié)合魚腥草活性成分相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)化合物進(jìn)行篩選,設(shè)定篩選標(biāo)準(zhǔn)為口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18或符合Lipinski類藥性五原則均納入,并結(jié)合魚腥草活性成分相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)可能遺漏的有效成分進(jìn)行補(bǔ)充[6-7]。
利用TCMSP中的藥物相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)功能,收集魚腥草有效成分的作用靶點(diǎn),并使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)將靶點(diǎn)名稱統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為基因名,合并重復(fù)靶點(diǎn)并刪除無(wú)對(duì)應(yīng)基因名的靶點(diǎn)以便后續(xù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D構(gòu)建。以關(guān)鍵詞“dry eye”“xerophthalmia”在GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索,得到干眼疾病相關(guān)靶點(diǎn)。對(duì)兩者取交集匹配,初步得到魚腥草與干眼相關(guān)的作用靶點(diǎn),即魚腥草治療干眼的潛在作用靶點(diǎn)。
將所得到的魚腥草治療干眼的潛在作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件,進(jìn)行可視化操作,構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D。其中,節(jié)點(diǎn)代表魚腥草及其有效成分、干眼疾病、作用靶點(diǎn)等;邊代表魚腥草與有效成分、有效成分與作用靶點(diǎn)、干眼疾病與作用靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系。
將所得到的魚腥草治療干眼的潛在作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)中,物種定義為“Homo sapiens”,即“人類”,構(gòu)建魚腥草治療干眼的PPI網(wǎng)絡(luò),去除無(wú)相互作用關(guān)系的靶點(diǎn),輸出PPI網(wǎng)絡(luò)圖并統(tǒng)計(jì)關(guān)鍵靶點(diǎn)度(degree)值。
利用Bioconductor(http://www.bioconductor.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)R語(yǔ)言軟件包對(duì)魚腥草治療干眼的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,設(shè)定P<0.05,得到關(guān)鍵靶點(diǎn)及其參與和影響的關(guān)鍵功能和關(guān)鍵作用通路。
TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共收錄魚腥草化學(xué)成分50種,根據(jù)類藥性相關(guān)規(guī)則進(jìn)行化合物篩選,并結(jié)合魚腥草活性成分相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)可能遺漏的有效成分進(jìn)行補(bǔ)充,得到包括癸醛、乙酸龍腦酯、山柰酚、槲皮素、蘆丁等在內(nèi)的有效成分共30種,化合物名稱及相對(duì)分子質(zhì)量(MW)、脂水分配系數(shù)(AlgP)、氫鍵供體數(shù)(Hdon)、氫鍵受體數(shù)(Hacc)、OB、DL數(shù)據(jù)見表1。
共收集到魚腥草有效成分作用靶點(diǎn)347個(gè),干眼疾病靶點(diǎn)3650個(gè),藥物與疾病靶點(diǎn)取交集后得到潛在作用靶點(diǎn)128個(gè)。
構(gòu)建的魚腥草治療干眼的“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖如圖1所示,圖中共有節(jié)點(diǎn)153個(gè),分別代表藥物魚腥草(綠色塊)、干眼(紅色塊)、有效成分(紫色塊)及基因靶點(diǎn)(藍(lán)色塊);邊412條,代表各屬性之間的相互作用關(guān)系。從圖1中可以看出,魚腥草治療干眼的有效成分有23個(gè),包括癸醛、乙酸龍腦酯、山柰酚、槲皮素、蘆丁等;根據(jù)Cytoscape 3.7.2軟件分析結(jié)果(表2),其中起主要作用(與各靶點(diǎn)聯(lián)系較多,即度值較高的)的有山柰酚、槲皮素、蘆丁等。
表1 魚腥草有效成分
圖1 魚腥草治療干眼的“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D
表2 魚腥草治療干眼的核心化合物
魚腥草治療干眼的潛在作用靶點(diǎn)之間PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建見圖2,為顯示更簡(jiǎn)潔,設(shè)定最小combined score>0.9。圖中蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)共128個(gè),相互作用的邊383條,其中度值排名前20位的靶點(diǎn)見圖3,前10名關(guān)鍵靶點(diǎn)分別是Jun、蛋白激酶B1(Akt1)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RelA)、白細(xì)胞介素-8(CXCL8)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、MAPK8和IL-1β。
圖4所示為魚腥草治療干眼的潛在作用靶點(diǎn)GO功能富集結(jié)果,可以看到潛在靶點(diǎn)參與調(diào)控的功能主要有細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、受體配體活動(dòng)(receptor ligand activity)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、核受體活性(nuclear receptor activity)等。
注:圖中圓圈代表蛋白;圈與圈之間連線代表兩者之間存在相互作用關(guān)系。
圖3 魚腥草治療干眼排名前20的靶點(diǎn)
魚腥草治療干眼的潛在作用靶點(diǎn)KEGG通路富集結(jié)果如圖5所示,主要富集在與糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化產(chǎn)物及其受體信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、絲裂原激活的蛋白激酶信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、白細(xì)胞介素-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、缺氧誘導(dǎo)因子1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)、松弛素信號(hào)通路(relaxin signaling pathway)等有關(guān)的通路上,提示魚腥草治療干眼的機(jī)制可能與抗晚期糖基化、抗炎、抑制細(xì)胞凋亡等相關(guān)。
干眼是近年來(lái)得到廣泛關(guān)注的眼表疾病之一,截至2018年,全球的干眼發(fā)病率為5.5%~33.7%,我國(guó)的干眼發(fā)病率為21%~30%[8]。干眼的發(fā)病因素很多,包括環(huán)境、年齡、性別及全身性疾病在內(nèi)的許多因素都會(huì)導(dǎo)致干眼[9]。此外,還有視屏終端綜合征、空氣污染等危險(xiǎn)因素。中醫(yī)認(rèn)為陰虛津虧、燥傷津液是干眼發(fā)病的主要原因[10],而西醫(yī)則認(rèn)為其發(fā)病除淚膜不穩(wěn)定這一核心機(jī)制外,與眼表高滲透壓、眼表炎癥、神經(jīng)感覺異常等機(jī)制亦有關(guān)聯(lián)[9]。針對(duì)這些病因,臨床干眼治療多從保持眼球濕潤(rùn)、抗炎、滋陰等方面入手,西醫(yī)主要方法是使用針對(duì)病因的滴眼液點(diǎn)眼治療,此種方法作用效果單一,因此魚腥草滴眼液等中藥滴眼液近年在臨床使用日趨廣泛。
圖4 魚腥草治療干眼靶點(diǎn)的GO功能富集分析
圖5 魚腥草治療干眼靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析
本研究通過(guò)構(gòu)建魚腥草滴眼液治療干眼的“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò),對(duì)魚腥草治療干眼的潛在作用機(jī)制進(jìn)行探究。結(jié)果顯示,魚腥草在治療干眼時(shí)發(fā)揮核心作用的化合物有槲皮素、山柰酚和蘆丁,三者均屬黃酮類化合物,具有豐富的藥理活性,廣泛存在于食用和藥用植物中。實(shí)驗(yàn)證實(shí),山柰酚能夠抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生[11],減少TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA的表達(dá),發(fā)揮抗氧化和抗炎作用;還可抑制凋亡蛋白表達(dá),發(fā)揮抗凋亡作用[12];此外還具有抗癌、保護(hù)神經(jīng)等作用[13]。槲皮素作用與其類似[14],除抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用外,還具有廣譜抑菌活性,對(duì)包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的多種細(xì)菌發(fā)揮抑制作用[15],而金黃色葡萄球菌是容易導(dǎo)致眼表炎癥的重要細(xì)菌之一。蘆丁可清除自由基,抗氧化作用顯著,亦可發(fā)揮抗病毒、抑菌、抗炎等作用[16]。
魚腥草治療干眼的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)錄因子Jun、Akt1、MAPK1、IL-6、RelA、CXCL8、VEGFA、EGFR、MAPK8和IL-1β10個(gè)靶點(diǎn)可能是與作用機(jī)制相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn),而GO分析則提示,上述關(guān)鍵靶點(diǎn)通過(guò)影響細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活動(dòng)、細(xì)胞因子活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、整合蛋白結(jié)合等功能對(duì)干眼進(jìn)行調(diào)控。干眼的發(fā)生發(fā)展過(guò)程涉及眾多細(xì)胞因子,這些細(xì)胞因子及其受體配體的活性影響炎癥、細(xì)胞凋亡等相關(guān)發(fā)病過(guò)程[9]。Jun參與了轉(zhuǎn)錄因子激活子蛋白-1(AP-1)的合成,轉(zhuǎn)錄因子AP-1不僅調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)化,還參與了體內(nèi)免疫系統(tǒng)調(diào)控,從而能夠影響炎癥反應(yīng)[17]。Akt1作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在調(diào)控細(xì)胞凋亡與生長(zhǎng)增殖方面發(fā)揮著重要作用。CXCL-8即IL-8,與IL-6、IL-1β都是重要的炎癥介質(zhì),在干眼患者淚液及血液中的高表達(dá)證實(shí)了干眼由炎癥介導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制,一定程度上對(duì)干眼的嚴(yán)重程度產(chǎn)生了影響[18-19]。它們與受體結(jié)合后能夠使多種炎癥因子釋放[20],并導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的生物效應(yīng)發(fā)生,絲裂原激活的蛋白激酶通路就是其中之一。MAPK1和MAPK8均屬于絲裂原活化蛋白激酶家族,其表達(dá)與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。有研究表明,MAPK信號(hào)通路參與了高滲透壓導(dǎo)致的角膜上皮損傷,這是干眼發(fā)病機(jī)制的又一新線索[21]。RelA是核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的一種蛋白質(zhì)亞基,其翻譯后修飾能夠參與調(diào)控NF-κB的各項(xiàng)功能,如抑制細(xì)胞凋亡[22]。EGFR與相應(yīng)配體結(jié)合后會(huì)激活相應(yīng)通路控制相應(yīng)細(xì)胞增殖分化,淚液中表皮生長(zhǎng)因子(EGF)對(duì)于維持眼表微環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要意義[23],而干眼的眼表微環(huán)境損害則可能與EGF表達(dá)下調(diào)有關(guān)。VEGFA為VEGF的一種,VEGF參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,在糖尿病干眼患者淚液中有高表達(dá)[24],VEGF及其受體與角膜損傷過(guò)程亦有密切的關(guān)系[25]。這些靶點(diǎn)都是魚腥草治療干眼的關(guān)鍵靶點(diǎn),提示魚腥草治療干眼可能與抑制或阻止角膜上皮損傷形成有關(guān)。
根據(jù)KEGG通路富集分析結(jié)果,魚腥草治療干眼的潛在作用靶點(diǎn)主要富集在與炎癥、細(xì)胞凋亡、腫瘤代謝等過(guò)程相關(guān)的通路上,其中糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化產(chǎn)物及其受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路顯著性較高。糖尿病晚期糖基化被認(rèn)為是糖尿病角膜神經(jīng)病變發(fā)生發(fā)展的重要因素[26],而角膜神經(jīng)病變可進(jìn)一步引起淚腺功能受到抑制,進(jìn)而導(dǎo)致干眼;該通路中包含的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信號(hào)通路被證實(shí)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),同時(shí)還能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的調(diào)控過(guò)程[27],發(fā)揮與TNF及IL-17相似的作用。HIF-1由α和β2個(gè)亞單位組成,其中HIF-1α能夠調(diào)控免疫細(xì)胞的存活和促炎因子的表達(dá),同時(shí)作為介導(dǎo)缺氧信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中樞參與多條細(xì)胞信號(hào)通路,影響著與細(xì)胞增殖凋亡、腫瘤生長(zhǎng)、細(xì)胞自噬等有關(guān)的各種生理過(guò)程[28]。
綜上分析推測(cè),魚腥草滴眼液治療干眼的作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)潛在作用靶點(diǎn)相關(guān)蛋白的表達(dá),調(diào)控與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等相關(guān)的通路,達(dá)到抗炎、抑制細(xì)胞凋亡等目的,從而抑制角膜上皮損傷,抑制干眼的發(fā)生發(fā)展。但這一結(jié)論僅是數(shù)據(jù)推測(cè),存在一定的局限性,比如化合物篩選標(biāo)準(zhǔn)不全面,可能遺漏實(shí)際有效成分;疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)范圍較小,可能不能囊括所有與干眼相關(guān)的基因靶點(diǎn),推測(cè)結(jié)果可能與實(shí)際關(guān)鍵靶點(diǎn)不符等,故此結(jié)論仍有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步論證。