王麗娟，梁曉磊，楊永秀

1 背景

卵巢癌是威脅女性健康的高度惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構2018年全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2018年全球約有29.5萬新發(fā)病例，其中約18萬死亡。卵巢腫瘤中以上皮性腫瘤最常見，約占50%～70%。年齡、家族史、排卵周期及突變基因(如乳腺癌1/2號基因)等是其重要危險因素。卵巢癌早期往往無明顯癥狀，加之初發(fā)癥狀常常缺乏特異性，與消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)癥狀難以鑒別，因此常規(guī)診療程序如婦科檢查、血清CA125和經(jīng)陰道超聲檢查通常不能發(fā)現(xiàn)早期卵巢癌[1]，超過一半的患者確診時已是晚期并已發(fā)生轉移[2]，5年生存率僅有20%～25%[3-4]，而對于能早期診斷的患者，5年生存率可達90%[5]?，F(xiàn)階段卵巢癌標準治療手段是腫瘤細胞減滅術加鉑類等化療藥的綜合治療，盡管完全緩解率高達60%～80%，但仍有近50%的患者后期會出現(xiàn)化療耐藥或復發(fā)[6]。卵巢癌的轉移與化療耐藥是當前卵巢癌治療面臨的重要困難。因此，明確卵巢癌發(fā)生發(fā)展、轉移、耐藥的特有機制，發(fā)現(xiàn)對應的有效靶點是當前卵巢癌研究所必須解決的。

腫瘤內異質性(intratumoral heterogeneity，ITH)是指腫瘤中含有表型各不相同的細胞亞克隆，從而在細胞增殖、侵襲、轉移能力及治療反應等方面表現(xiàn)不同[7]。癌癥在癌細胞及其微環(huán)境的相互作用下動態(tài)發(fā)展，異質性也在這個過程中逐步形成。有人認為遺傳不穩(wěn)定性是腫瘤發(fā)展中產(chǎn)生異質性的基礎，早在1958年，進化生物學家Huxley就已經(jīng)提出了癌癥中“遺傳不均一性”的觀點[8]。由外源性刺激(如煙霧或紫外線等)和內源性染色體畸變推動腫瘤進展，使得癌細胞發(fā)生遺傳與表型變異，衍生ITH，癌細胞帶著不同的分子特征，對抗癌治療表現(xiàn)出不同的敏感性，進而在治療過程中出現(xiàn)耐藥[9]。如果說遺傳不穩(wěn)定是ITH的啟動劑，那么克隆進化學說就是維持劑，這一學說最早在1976年由Peter Nowell提出[10]，不斷擴大的腫瘤細胞群在遺傳變異的作用下產(chǎn)生多個亞克隆，進一步通過克隆進化實現(xiàn)發(fā)展增殖，在實體腫瘤中多采用分支進化模式，由一個共同祖先產(chǎn)生多個亞克隆進化；而在部分血液腫瘤中則發(fā)生線性進化，通過連續(xù)突變促進有生存優(yōu)勢的進化[11](見圖1,彩插1)。

ITH的出現(xiàn)可能使從單個腫瘤活檢樣本中描繪的基因組圖譜變得局限，同時對疾病生物標志物的開發(fā)和對患者個體治療方案的制定提出重大挑戰(zhàn)。在精準醫(yī)療的大背景下，我們需要以個體為基礎，利用當代網(wǎng)絡大數(shù)據(jù)資源對個體的所有生物學特性、環(huán)境因素、疾病相關因素進行有機整合，準確判斷個體腫瘤發(fā)展狀態(tài)，制定真正的個體化治療方案。

2 卵巢癌腫瘤內異質性的分子機制

利用基因組測序的手段發(fā)現(xiàn)生物體內主要是體細胞突變及拷貝數(shù)變異導致了腫瘤內表型的多樣性。Nakamura K等[12]選取1例67歲高級別漿液性卵巢癌患者，對3個腫瘤區(qū)域中約160個與癌癥相關的基因突變進行研究，在病理切片中發(fā)現(xiàn)從區(qū)域a到區(qū)域c細胞核異性程度增加，測序結果顯示在區(qū)域b和c中ERBB2擴增，拷貝數(shù)(CN)=32(b)、26(c)，而在區(qū)域a中ERBB2僅輕微擴增(CN=6)；在區(qū)域c中檢測到KRAS擴增(CN=4)，但在區(qū)域a和b中未檢測到。在3個不同區(qū)域中觀察到了體細胞突變的差異及拷貝數(shù)的變異，再一次提示這種腫瘤進化出的亞克隆是阻礙靶向治療的攔路石。對于高級別漿液性卵巢癌，最普遍的遺傳特征是TP53突變，但是在腫瘤發(fā)展中，該基因亦存在錯義突變，發(fā)展出無P53表達的亞組，并有研究發(fā)現(xiàn)，相比于其他TP53突變的亞型，這類腫瘤預后更差[13]。為進一步明確無P53卵巢癌的ITH，Alba等[14]選取來自同一患者的6個原發(fā)灶、2個盆腔內復發(fā)灶和4個盆腔外復發(fā)灶樣本進行全外顯子測序，結果顯示發(fā)現(xiàn)的102個基因突變中只有42個在所有樣本中共有；存在拷貝數(shù)變異的18個基因也僅有7個在所有樣本中檢測到，同時研究者也發(fā)現(xiàn)了其中與卵巢癌復發(fā)最具相關性的基因，如GPNMB、TFDP1。

除了最常見的高級別漿液性卵巢癌，在一些特殊類型卵巢癌中亦發(fā)現(xiàn)具有典型的時間(原發(fā)灶與轉移灶之間的差異)和/或空間(瘤灶內部差異)異質性。Arnaud等[15]研究發(fā)現(xiàn)成人型卵巢顆粒細胞瘤是一種罕見的卵巢癌，其潛伏期長，復發(fā)率高，在對原發(fā)灶和配對復發(fā)灶行sanger測序后發(fā)現(xiàn)，在復發(fā)灶中TP53、TET2、MED12等基因發(fā)生突變，表示了與疾病進展和復發(fā)的相關性。在一項關于卵巢透明細胞癌的研究中，研究者選取6例患者，每個樣本選取4個區(qū)域進行全基因組測序，共發(fā)現(xiàn)七千多個體細胞突變，112個拷貝數(shù)變異，作者指出這種基因突變驅動的ITH對腫瘤的分子檢測和靶向治療具有重要意義[16]。隨著測序技術的持續(xù)發(fā)展，越來越多的研究利用全外顯子測序、單細胞測序、T細胞受體測序等手段對ITH進行探究[17-19]，不僅揭示了腫瘤內不同區(qū)域的克隆進化，更闡明了異質性發(fā)生的分子機制，指出重要突變和拷貝數(shù)變異作為潛在治療靶標的重要性。

3 卵巢癌腫瘤內異質性的系統(tǒng)進化與量化

腫瘤多區(qū)域測序的發(fā)展，使靶向治療逐漸進入臨床醫(yī)生的視野，但在治療過程中出現(xiàn)的耐藥性又日益凸顯出疾病進化研究的重要性，提示需要進一步研究實現(xiàn)對疾病發(fā)展的預測。Thomas等[20]提出以多區(qū)域測序結果為基礎，構建“系統(tǒng)發(fā)育樹”可以較好地表示患者腫瘤的進化過程，即在腫瘤發(fā)展過程中，癌細胞的進化并不是遵循順序或線性規(guī)律，而是將每個新產(chǎn)生的突變作為一個分支，最終形成樹狀結構，隨后，可以通過統(tǒng)計數(shù)據(jù)對ITH進行量化，例如總平均樹長，即從樹根到葉節(jié)點的平均突變數(shù)，表示為與樣本數(shù)無關的平均突變負擔。在Lee等[21]的研究中就應用了“系統(tǒng)發(fā)育樹”，研究標本取自1例71歲的IIIC期卵巢癌患者，共包括7個腫瘤樣本、3個轉移樣本，利用全外顯子測序數(shù)據(jù)構建“系統(tǒng)發(fā)育樹”，形成兩個原發(fā)腫瘤簇(P1、P2)和一個轉移簇(M)，分析比較后發(fā)現(xiàn)P1、P2簇在腫瘤發(fā)育早期就發(fā)生了分化，而M簇中的基因結構與P1簇相似，具有較少的基因突變和拷貝數(shù)變異，從“系統(tǒng)發(fā)育樹”中發(fā)現(xiàn)除了亞克隆進化，腫瘤微環(huán)境也可能通過分泌一些誘導因子促進腫瘤的生長與轉移。有一種觀點認為輸卵管病變是卵巢癌的前體病變[22]，為明確疾病順序，Jeremy等[23]利用4例患者的9個不同區(qū)域進行二代測序以分析單核苷酸變異，構建卵巢腫瘤和腹腔轉移腫瘤的“系統(tǒng)發(fā)育樹”，量化突變分支與樹根距離后發(fā)現(xiàn)，轉移分化發(fā)生于早期，且與原發(fā)腫瘤突變相似，進一步證明卵巢癌起源于輸卵管病變的觀點。

為明確腫瘤內亞克隆導致的異質性是否與患者預后相關，Schwarz等[24]開發(fā)了用于腫瘤內拷貝數(shù)比較的最小事件距離算法對ITH的系統(tǒng)進化進行定量分析，共納入14例接受鉑類藥物治療患者的135個樣本進行全基因組測序，量化結果用腫瘤間克隆擴增程度(clonal expansion，CE)表示，以中位數(shù)0.74將樣本分為高CE組和低CE組，比較后發(fā)現(xiàn)每位患者均表現(xiàn)出很高的異質性，同時觀察到CE值與患者預后相關，即與低CE組相比高CE組生存期較短(總生存期：12.7月vs 42.6月；無進展生存期：10.1月vs 23.5月)。綜上可見，“系統(tǒng)發(fā)育樹”可以較準確地描繪腫瘤的進化軌跡，結合“系統(tǒng)發(fā)育樹”的量化可以作為腫瘤的預后指標。

4 卵巢癌腫瘤異質性的臨床意義

最具治療前景的分子靶向療法是基于單一樣本的基因組圖譜分析，找出疾病發(fā)生的關鍵基因將其視為癌癥驅動因子，針對關鍵基因進行的靶向治療，但是研究發(fā)現(xiàn)，盡管初期治療反應良好，后期幾乎所有癌癥都會對靶向藥物產(chǎn)生耐藥[25-27]。耐藥性是患者長期生存的一大威脅，同時也是醫(yī)生進行治療的一大難題，這主要是ITH造成的，如果對異質性進行更深入的研究，或許能克服這一困難，同時開發(fā)異質性在腫瘤診斷及治療方面的作用，可為卵巢癌患者帶來福音。在Takaya等[28]的研究中揭示了異質性與卵巢癌預后的關系，通過TCGA數(shù)據(jù)庫納入502例基因芯片數(shù)據(jù)，利用克隆指數(shù)(cloning index，CI)和雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)得分對異質性量化，將病例分為4組：高CI/高LOH組、高CI/低LOH組、低CI/低LOH組、低CI/高LOH組，無進展生存期分別為：16.8月、16.6月、15.0月、22.6月；總生存期分別為：49.5月、38.6月、38.6月、55.1月，其中低CI/高LOH組預后最佳，由此可見ITH與卵巢癌預后顯著相關，有望利用ITH量化手段構建預后預測模型，指導臨床治療。在診斷方面，Choi等[29]對卵巢癌樣本和腹水癌細胞的全外顯子測序分析后首次發(fā)現(xiàn)腹水癌細胞通過整合ITH可以重建整個卵巢癌的基因組，由此推斷可將其作為發(fā)現(xiàn)對卵巢癌具有診斷和治療意義的體細胞突變的潛在資源。傳統(tǒng)靶向治療產(chǎn)生耐藥的機制認為主要是由“系統(tǒng)發(fā)育樹”中分支亞克隆突變驅動產(chǎn)生的，對于ITH，靶向單個優(yōu)勢克隆或許會破壞各亞克隆間原有的相互作用，研究者認為可以依據(jù)“系統(tǒng)發(fā)育樹”中的突變次序，采取順序或組合靶向治療策略，從而有效延長患者生存期[30]。

5 小結

卵巢癌惡性程度高、發(fā)現(xiàn)晚、易復發(fā)和耐藥的特性嚴重影響患者生理、心理。綜合本文所述，ITH在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，越來越多的研究揭示了異質性與耐藥的相關性，同時，更多的證據(jù)指出異質性的量化與卵巢癌不良預后有關。因此，明確ITH的發(fā)生機制有助于尋找疾病發(fā)展的關鍵驅動因子，結合基因組學研究描繪疾病發(fā)展軌跡，是預判后期進展、指導臨床治療的最具潛力的途徑。為實現(xiàn)精準醫(yī)療，我們需要進一步了解腫瘤內關鍵驅動基因及其異質性的變化，探索腫瘤進化史，研究異質性與腫瘤微環(huán)境的相互作用，尋找促進腫瘤發(fā)展的規(guī)律，探索順序或組合靶向治療手段，為新靶向治療提供研究基礎。