劉科鵬,高 珊，李麗斐，趙 薛，郭雅瓊，劉 媛,張學(xué)紅

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖?？漆t(yī)院，蘭州 730000;2.西北民族大學(xué)，蘭州 730000;3.甘肅省衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，蘭州 730000)

近年來輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)有了很大的發(fā)展，但反復(fù)種植失敗(recurrent implantation failure，RIF)仍是臨床醫(yī)生和許多患者共同面臨的難題。歐洲人類生殖與胚胎學(xué)學(xué)會(huì)將RIF定義為：連續(xù)3次移植，其中每個(gè)周期轉(zhuǎn)移1～2枚高質(zhì)量的胚胎，或在多次移植中轉(zhuǎn)移10個(gè)或10個(gè)以上胚胎，胚胎移植5周或更長時(shí)間后，在超聲檢查中沒有觀察到妊娠囊[1]。植入和妊娠受胚胎和母親因素的影響，胚胎因素與遺傳異?；蚺咛ス逃械钠渌蛩赜嘘P(guān)。母親因素包括子宮解剖形態(tài)異常、免疫因素、子宮內(nèi)膜容受性降低和血栓形成[2]，其中子宮內(nèi)膜容受性降低導(dǎo)致的移植失敗占總數(shù)的2/3以上[3]。目前臨床上有多種方法用于治療RIF，但是其療效往往不佳，因此迫切需求一種新的治療方案。富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)包含多種生長因子和細(xì)胞因子：血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)，胰島素樣生長因子I，II(insulin-like growth factors，IGF I，II)，轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)，肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)，結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)和白介素8(interleukin 8，IL-8)。這些生長因子和細(xì)胞因子可促進(jìn)各種細(xì)胞的增殖、遷移和組織再生[4]。研究表明，在IVF周期中，PRP宮腔灌注可改善薄型子宮內(nèi)膜患者的子宮內(nèi)膜厚度和子宮內(nèi)膜容受性，繼而改善妊娠結(jié)局[5-6]。本研究設(shè)計(jì)前瞻性對照試驗(yàn)，以評(píng)估PRP宮腔灌注可否改善RIF患者IVF周期的妊娠結(jié)局。

1 資料與方法

1.1 研究人群 采用單中心前瞻性對照試驗(yàn)(平衡隨機(jī))，選取2018年6月至2019年7月在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖?？漆t(yī)院擬行凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET)周期的176例RIF患者，患者經(jīng)3次或3次以上移植優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎后仍未受孕，擬再次行FET。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡低于40歲，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)低于30kg/m2，根據(jù)形態(tài)學(xué)評(píng)估至少可獲得一枚優(yōu)質(zhì)胚胎。排除標(biāo)準(zhǔn)：女方子宮異常(先天性或后天性)，激素異常，夫妻中一方染色體異常，免疫學(xué)和血液學(xué)異常，男方因素導(dǎo)致的異常。按納入排除標(biāo)準(zhǔn)排除49例患者，其余127例進(jìn)入下一步研究。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 根據(jù)治療方案將患者隨機(jī)分為PRP組和對照組,對患者進(jìn)入周期前行宮腔鏡檢查。對患者的血栓形成、抗磷脂抗體、激素紊亂、血液學(xué)和免疫學(xué)疾病進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查。參與者均行FET周期治療，并使用激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜。FET周期方案：從月經(jīng)周期的第2天開始口服戊酸雌二醇(Bayer Schering Pharma，法國)6mg/d，于周期第10天行陰道超聲檢查。如子宮內(nèi)膜厚度未達(dá)到7mm，將戊酸雌二醇使用量增加至8mg/d。子宮內(nèi)膜厚度超過7mm時(shí)，2次/d使用400mg孕酮栓劑(Cyclogest；Actavis，英國)進(jìn)行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，持續(xù)3天后進(jìn)行胚胎移植，移植的胚胎中至少有1個(gè)為優(yōu)質(zhì)胚胎。所有移植過程均在超聲指導(dǎo)下由同一名婦科醫(yī)生進(jìn)行。胚胎移植步驟根據(jù)2013年美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)(ASRM)指南[7]。PRP組于胚胎移植前48h進(jìn)行宮腔灌注PRP 1ml。胚胎移植后持續(xù)補(bǔ)充戊酸雌二醇和孕酮2周，如發(fā)生妊娠，則持續(xù)補(bǔ)充至妊娠12周。

PRP的制備及灌注:在灌注當(dāng)天使用兩步離心法從自體血液中制備PRP。在預(yù)裝有1.5ml檸檬酸鹽抗凝溶液(ACD-A)的注射器中抽取8.5ml外周靜脈血，300×g離心10min。血液分為三層：底部紅細(xì)胞、上清液的血漿以及中間的血沉棕黃層。將血漿層和血沉棕黃層收集到另一離心管，700×g再次離心15min，最后獲得1.5ml PRP，其濃度約為循環(huán)血液的4～5倍。立即使用胚胎移植(ET)管將約1ml PRP注入子宮腔。

1.3 觀察方法及指標(biāo) 主要觀察指標(biāo)：患者的胚胎種植率、化學(xué)妊娠率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率。胚胎種植率定義為胚胎移植后5周在陰道超聲下觀察到的妊娠囊與移植胚胎數(shù)的比值?；瘜W(xué)妊娠定義為胚胎移植后14天血清β-HCG≥50IU/L，臨床妊娠定義為胚胎移植后5周在陰超下觀察到妊娠囊和胎心搏動(dòng)，妊娠20周后繼續(xù)妊娠時(shí)即為持續(xù)妊娠。次要觀察指標(biāo)：胚胎移植日子宮內(nèi)膜厚度、子宮動(dòng)脈搏動(dòng)指數(shù)(pulsatility index，PI)和子宮動(dòng)脈阻力指數(shù)(resistance index，RI)。每例患者測量2次，并取平均值作為最后取值。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較 176例無系統(tǒng)性疾病的RIF患者中，127例完成了本研究。兩組患者的年齡、BMI、移植失敗次數(shù)、不孕類型比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組患者的一般臨床資料

2.2 治療后兩組間子宮內(nèi)膜厚度、子宮動(dòng)脈血流參數(shù)比較 胚胎移植日PRP組的子宮內(nèi)膜厚度均大于對照組(P<0.05)，PI、RI均小于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組胚胎移植日子宮內(nèi)膜厚度、子宮動(dòng)脈血流參數(shù)比較

2.3 兩組的妊娠結(jié)局比較 PRP組的胚胎種植率顯著高于對照組(24.4% vs 12.6%，P<0.05)。PRP組的臨床妊娠率顯著高于對照組(39.6% vs 18.8%，P<0.05)，見表3。

表3 兩組的妊娠結(jié)局

3 討 論

子宮內(nèi)膜容受性降低，子宮解剖形態(tài)異常，薄型子宮內(nèi)膜，免疫異常，血栓形成，胚胎異常均可導(dǎo)致RIF。RIF是限制IVF成功率的主要因素之一。目前臨床上有多種方法用于治療RIF，其療效往往不佳，迫切需求一種新的治療方案。

PRP被定義為“血小板計(jì)數(shù)高于基線的血漿”[8]。在正常生理?xiàng)l件下，血小板中所包含的多種組分協(xié)同作用以促進(jìn)創(chuàng)面愈合。血小板攜帶近900種蛋白質(zhì)，包括細(xì)胞因子、生長因子、干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的趨化因子，負(fù)責(zé)1400多種生物活性因子的翻譯后調(diào)節(jié)[9]。血小板中所含的生長因子具有修復(fù)組織、促進(jìn)有絲分裂、趨化、新生血管和抗炎作用的能力[10]。PRP已應(yīng)用于多個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括糖尿病性潰瘍、骨關(guān)節(jié)炎、肌腱炎、牙齒疾病、美容修復(fù)、神經(jīng)損傷、心肌損傷和脫發(fā)[11-14]。

子宮內(nèi)膜接受植入胚胎僅限于排卵后6～12天左右，這段時(shí)間被稱為種植窗口期。在種植窗口期，生長因子、細(xì)胞因子、前列腺素和黏附分子表達(dá)增加，這些生長因子表達(dá)異常會(huì)降低胚胎植入率和臨床妊娠率。Green等[15]證明了IGF I在植入過程中的基本作用。Sak等[16]研究表明，在RIF女性的子宮內(nèi)膜中，生長因子(如血管內(nèi)皮生長因子)表達(dá)減少。因此，通過宮腔灌注PRP補(bǔ)充各種生長因子，可能有益于調(diào)節(jié)和改善子宮內(nèi)膜容受性，提高胚胎植入率和臨床妊娠率。

2015年Chang等[17]首先提出了PRP宮腔灌注可促進(jìn)薄型子宮內(nèi)膜生長，5例因子宮內(nèi)膜過薄而取消周期的患者，經(jīng)PRP宮腔灌注治療后，子宮內(nèi)膜厚度增加至8mm以上，其中4例獲得妊娠。隨后一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究中，45例RIF婦女在胚胎移植前48h接受了PRP宮腔灌注，其中PRP的濃度是血小板的4～5倍，共計(jì)19例患者獲得臨床妊娠[18]。這些臨床試驗(yàn)均表明PRP宮腔灌注可改善薄型子宮內(nèi)膜婦女的妊娠結(jié)局。PRP宮腔灌注在胚胎植入過程中的分子機(jī)制可能為：(1)活化的PRP直接促進(jìn)人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、子宮內(nèi)膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)和源自骨髓的MSC的增殖和遷移[19]；(2)PRP在胚胎植入過程中對增殖、凋亡、炎癥、細(xì)胞黏附、趨化性和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用[20]；(3)通過多種途徑促進(jìn)細(xì)胞再生、增殖和新生血管的形成[21]；(4)通過化學(xué)吸引作用促進(jìn)細(xì)胞遷移和分化[22]；(5)刺激促炎性細(xì)胞因子(IL1A，IL1B，IL1R2)、趨化因子(CCL5，CCL7，CXCL13)和基質(zhì)金屬蛋白(MMP-3，MMP-7，MMP-26)的表達(dá)，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜容受性[23]。

本研究結(jié)果顯示，RIF患者再次IVF-ET過程中行PRP宮腔灌注有助于改善妊娠結(jié)局，PRP組與對照組相比較，胚胎種植率(24.4% vs 12.6%)、臨床妊娠率(39.6% vs 18.8%)均顯著提高(P<0.05)，PRP組的子宮內(nèi)膜厚度高于對照組，而子宮動(dòng)脈PI和子宮動(dòng)脈RI都小于對照組，子宮內(nèi)膜血流呈低阻力。提示PRP宮腔灌注可促進(jìn)內(nèi)膜的生長，增加子宮內(nèi)膜厚度，改善子宮內(nèi)膜血流，增加胚胎種植的營養(yǎng)供給，繼而有可能改善了子宮內(nèi)膜容受性。

綜上所述，富血小板血漿宮腔灌注有助于改善RIF患者的妊娠結(jié)局。但本研究樣本量較小，仍需大樣本隨機(jī)對照試驗(yàn)的數(shù)據(jù)支持。