譚煒富 李薇

暨南大學(xué)附屬東莞醫(yī)院新生兒科 523900

牛奶蛋白過敏（cow’s milk protein allergy，CMPA）是由一種或多種牛奶蛋白介導(dǎo)的與遺傳相關(guān)的免疫反應(yīng)，是嬰兒在出生后第1年內(nèi)發(fā)生過敏的最常見原因［1-2］。作為兒童時期最常見的過敏性疾病，CMPA 癥狀多表現(xiàn)為蕁麻疹、血管性水腫、嘔吐、腹瀉、便血、咳嗽、全身過敏反應(yīng)等，且可能與患兒未來發(fā)生慢性鼻炎、哮喘等有關(guān)［3］。近年來針對兒童CMPA 診治的研究迅速發(fā)展?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）因其具有調(diào)節(jié)腸道菌群失衡、提高機(jī)體抵抗力、誘導(dǎo)口服耐受等作用，可用于治療CMPA。

1 CMPA的流行病學(xué)及其發(fā)病機(jī)制

1.1 流行病學(xué) 食物過敏在兒童中的發(fā)病率較高，有研究指出其在幼兒中的發(fā)病率達(dá)6.25%～28.00%［4-5］。而兒童食物過敏在全世界范圍內(nèi)亦呈逐年上升趨勢。在中國，兒童食物過敏患病率已由1999 年的3.5%大幅上升至2009 年的7.7%，2012 年國內(nèi)9 個地區(qū)自報(bào)食物過敏率則達(dá)到了8.4%；而在美國，其患病率從1997—1999 年的3.4%上升至2009—2011年的5.1%［6-8］。針對CMPA的人群患病率，亦表現(xiàn)出其具地區(qū)差異性。2015 年歐洲一項(xiàng)包括來自9 個不同國家和地區(qū)的12 000 名兒童的出生隊(duì)列隨訪信息顯示，進(jìn)行數(shù)據(jù)調(diào)整后的CMA 總體患病率為0.59%，不同國家的患病率則在0%～1.3%［9］。而丹麥一項(xiàng)始于20 世紀(jì)90 年代的非選擇性3 歲兒童的隊(duì)列研究中，CMPA 的患病率為0.6%［10］。在中東地區(qū)，Katz 等［11］的一項(xiàng)包含13 234 名新生兒信息的單中心前瞻性研究顯示CMPA 的累計(jì)發(fā)病率達(dá)0.5%，其平均發(fā)病年齡為3.9 月齡。而有研究報(bào)道，中國南方地區(qū)CMPA患病率為2.69%［12］。

1.2 發(fā)病機(jī)制 CMPA 發(fā)病涉及一種或多種蛋白質(zhì)，其主要以乳清蛋白及酪蛋白作為過敏原。而CMPA 的發(fā)生受多因素的影響?，F(xiàn)有的雙胞胎和家族研究表明，遺傳成分可能在食物過敏的發(fā)生中起著重要作用［13-14］。Berni Canani 等［15］研究發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的CMPA 的耐受性獲得受Th2［白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-5］和Th1［IL-10、γ干擾素（IFN-γ）］相關(guān)細(xì)胞因子基因的表觀遺傳所控制。一項(xiàng)針對50 名巴西CMPA 兒童IL-10 基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，CMPA兒童-1082（rs1800896）A/G的G等位基因純合子較健康對照兒童更為常見，證明-1082 A/G 基因多態(tài)性的G 等位基因純合與兒童持續(xù)發(fā)生CMPA 有關(guān)［16］。除了上述遺傳因素外，還可能與母親食物過敏病史、孕期抗生素接觸史、母乳喂養(yǎng)時間長短、不必要的配方奶應(yīng)用等有關(guān)［17-19］。

近年來，腸道菌群狀態(tài)逐漸成為CMPA 發(fā)病機(jī)制研究的熱門課題?，F(xiàn)有研究表明，腸道菌群可影響腸道的屏障功能、免疫功能和營養(yǎng)物質(zhì)的利用，并可能通過胃腸道上皮的直接信號傳導(dǎo)來影響機(jī)體健康狀態(tài)［20-21］。有研究指出，嬰幼兒早期腸道微生物群變化可能影響兒童食物過敏結(jié)局［22-23］。亦有人提出現(xiàn)代生活方式和環(huán)境特征限制了生命早期微生物的腸道定植，從而影響了免疫耐受的自然發(fā)展過程，進(jìn)而導(dǎo)致了過敏性疾病的發(fā)生［24］。

2 兒童CMPA的治療

目前市面上有多種氨基酸配方奶粉、深度水解蛋白配方、大豆蛋白配方奶粉等替代配方被用以改善CMPA 患兒的CMPA 癥狀并取得良好的效果［25］。此外脫敏治療及免疫治療也具有廣闊的臨床應(yīng)用前景［26-27］。益生菌在新生兒腸道中定植，通過在腸道黏膜的排列及對腸道黏液分泌的刺激，可強(qiáng)化腸道屏障功能，維護(hù)腸道黏膜屏障的完整性。曾有學(xué)者總結(jié)了益生菌菌株的選擇及緩解過敏癥狀機(jī)制的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停l(fā)現(xiàn)在變態(tài)反應(yīng)研究中可通過判斷Th1/Th2平衡曲線選擇有用益生菌菌株［28］。其中，LGG 在許多動物和人類研究中均顯示其可改善腸道微生物平衡和過敏癥狀。尤其是，LGG對CMPA的抗過敏作用受到多方重視。

3 應(yīng)用LGG治療CMA的研究進(jìn)展

3.1 LGG 的生物學(xué)特性 LGG 是第一株發(fā)現(xiàn)的乳桿菌，屬益生菌，最初由Sherwood 和Barry 從健康人的糞便樣本中分離而來，并于1989 年獲得專利。由于其對酸和膽汁具有抵抗力，良好的生長特性以及可定植于腸上皮層，被認(rèn)定為潛在的益生菌菌株［29］。綜合前人研究，LGG 可通過以下機(jī)制發(fā)揮其腸道保護(hù)作用：（1）通過菌株直接作用或通過對腸道其他共生菌群產(chǎn)生影響而排除或抑制病原體［30］。（2）通過調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)途徑（如NF-κB，Akt 和MAPK 依賴性途徑）增強(qiáng)上皮屏障功能的能力，可引起黏液分泌或增強(qiáng)細(xì)胞緊密連接［31-32］。（3）可調(diào)節(jié)宿主機(jī)體免疫反應(yīng)，發(fā)揮菌株特異性局部和全身作用［33］。

3.2 LGG 治療CMPA 的動物學(xué)機(jī)制研究 Thang 等［34］首次應(yīng)用全牛奶蛋白構(gòu)建CMPA 小鼠模型探究LGG 對過敏進(jìn)程的影響。該研究將含有牛奶蛋白的磷酸緩沖液及以霍亂毒素為佐劑的牛奶蛋白溶液，通過管飼和腹膜注射方式誘發(fā)Balb/C 小鼠產(chǎn)生過敏癥狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予LGG不僅抑制Th2 細(xì)胞反應(yīng)，降低了小鼠模型超敏反應(yīng)評分及血清牛奶蛋白特異性IgG水平，同時還可通過誘導(dǎo)IFN-γ和升高牛奶蛋白特異性IgG2a水平以促進(jìn)Th1細(xì)胞反應(yīng)，提示LGG通過促使Th1/Th2平衡以治療機(jī)體CMPA癥狀。

通過予C3H/HeOuJ 小鼠口服以霍亂毒素為佐劑的β-乳球蛋白建立CMPA 模型，探究單獨(dú)使用深度水解酪蛋白配方（extensively hydrolyzed casein formula，EHCF）及聯(lián)合LGG 配方奶粉對小鼠過敏癥狀的影響。研究發(fā)現(xiàn)，口服EHCF 聯(lián)合LGG 更有利于過敏癥狀的緩解和發(fā)病機(jī)制的消除，其中LGG 的免疫作用更偏向于Th1 細(xì)胞的反應(yīng)［35］。另一通過β-乳球蛋白誘導(dǎo)的食物過敏小鼠模型中，采用LGG治療還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的緊密連接以增強(qiáng)腸道黏膜屏障功能［36］。

Chen 等［37-38］運(yùn)用Balb/C 小鼠探究β-乳球蛋白過敏導(dǎo)致的小鼠腸道損傷后LGG 的治療機(jī)制?？偨Y(jié)該團(tuán)隊(duì)2 項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，通過LGG治療后，小鼠受損的小腸絨毛獲得顯著恢復(fù)，腸道癥狀好轉(zhuǎn)。該系列研究對干預(yù)小鼠進(jìn)行了qPCR 分析，結(jié)果顯示LGG 影響了過敏小鼠TCR 通路上的IL4ra 和IL13ra2 基因的表達(dá)，導(dǎo)致該通路的IL4ra、IL13ra2 和Tglbr2 上調(diào)，同時導(dǎo)致Ifnar2 的下調(diào)。LGG 通過干預(yù)以上相關(guān)分子的基因表達(dá)以調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體信號（TCR）通路，進(jìn)而改變免疫細(xì)胞的分化方向，維持Th1/Th2平衡。除此以外，應(yīng)用LGG的小鼠其腸道類桿菌屬相對豐度增高，腸道代謝物中脫氧膽酸及石膽酸亦顯著升高，這提示LGG 還可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群及機(jī)體膽汁分泌等途徑以發(fā)揮其生物療效。

3.3 LGG 治療CMPA 患兒的臨床療效研究 2012 年發(fā)表的一項(xiàng)涉及美國和意大利的前瞻性隨機(jī)、雙盲、對照、交叉試驗(yàn)，共納入31 例確診為CMPA 的兒童。對納入病例隨機(jī)地先后予以單純EHCF 或每克混有108個LGG 的EHCF-LGG 奶粉喂養(yǎng)，并家庭喂養(yǎng)1 周。所有患兒均已停止接觸過敏原7 d，在患兒分別進(jìn)食不同的配方奶粉后進(jìn)行雙盲安慰劑食物激發(fā)試驗(yàn)（double-blind placebo-control food challenge，DBPCFC），間隔不少于2 h 后，再予另一配方奶粉，進(jìn)行口服食物激發(fā)試驗(yàn)。在此次研究中，29 例患兒2 次試驗(yàn)無過敏癥狀發(fā)生，其余2 例患兒中1 例患兒輕度鼻涕癥狀在試驗(yàn)前后未發(fā)生變化，另1 例試驗(yàn)前出現(xiàn)的瘙癢和皮疹癥狀得到改善。證明EHCF 中添加LGG 不會改變配方奶粉的低免疫原性，CMPA 患兒使用此類配方奶粉可獲得良好耐受［39］。

2013 年一項(xiàng)前瞻性臨床研究共納入260 例月齡在1～12 個月的CMPA 兒童，并分別持續(xù)予以喂養(yǎng)單純EHCF、添加LGG 的EHCF、大米水解配方、大豆配方及氨基酸配方奶粉1 年，并在喂養(yǎng)前及喂養(yǎng)1 年后進(jìn)行DBPCFC。將5 組患兒的耐受性評估結(jié)果進(jìn)行對比，給予添加LGG 的EHCF 患兒獲得口服耐受性比例達(dá)78.9%，明顯高于單純EHCF（43.6%）及其他配方奶粉喂養(yǎng)兒。此研究顯示，CMPA 患兒使用添加LGG 的EHCF 能更快地獲得口服耐受，有利于患兒生長發(fā)育［40］。

2015年一項(xiàng)研究，通過對20例健康兒及19例CMPA 患兒治療前后的糞便樣本進(jìn)行細(xì)菌菌群DNA 分離和16S rDNA測序，發(fā)現(xiàn)對于深度水解蛋白配方聯(lián)合LGG治療的患兒，無論最終是否獲得免疫耐受，其腸道菌群中勞特菌屬、羅斯菌屬和糞球菌屬比例均較治療前增加；對于產(chǎn)生牛奶蛋白耐受性的CMPA 患兒，其糞便中丁酸水平及勞特菌屬、羅斯菌屬的增加較未耐受患兒更為顯著［41］。此研究證實(shí)應(yīng)用益生菌LGG 有利于CMPA 患兒腸道菌群建立，可緩解患兒過敏癥狀。

2017年美國一項(xiàng)多中心、雙盲、平行對照研究，是對先前一項(xiàng)隨機(jī)對照試驗(yàn)的繼續(xù)探討。其先前研究將289名健康足月兒隨機(jī)分配喂養(yǎng)單純EHCF、添加LGG的EHCF以及添加LGG的PHF，并在30、90、120、150日齡進(jìn)行身體測量以及牛奶蛋白耐受性，最終有210例兒童完成研究。結(jié)果顯示，不同配方奶粉在以上時間點(diǎn)所測得的生長率、配方奶粉耐受性等無顯著差異。這證明添加LGG的深度和部分水解配方奶粉都支持健康足月兒的正常生長，且安全性一致。而此次研究則進(jìn)一步探究應(yīng)用添加LGG的水解配方奶粉的長期安全性。最終結(jié)果顯示，添加LGG的深度或部分水解配方均與5歲以下的正常生長發(fā)育有關(guān)，且沒有可歸咎于早期攝入LGG有關(guān)的不良事件發(fā)生［42］。換而言之，兒童1歲內(nèi)接受添加LGG的深度水解配方在5年內(nèi)也是安全可靠的。

2019 年一項(xiàng)回顧性分析，比較了深度水解乳清配方奶粉和添加LGG 的EHCF 治療CMPA 患兒的效果，其940例患兒病例數(shù)據(jù)均來源于英國“健康促進(jìn)網(wǎng)”。數(shù)據(jù)分析顯示，在開始使用配方奶粉后，使用深度水解乳清配方奶粉的嬰兒更容易發(fā)生過敏反應(yīng)（7.1%比3.1%，P＜0.02），提示應(yīng)用添加LGG 的EHCF 作為CMPA 患兒一線食品，可有效延緩過敏進(jìn)程［43］。

同年，意大利學(xué)者公布了一項(xiàng)關(guān)于LGG 飲食干預(yù)對CMPA 兒童表觀遺傳機(jī)制影響的隨機(jī)對照試驗(yàn)成果［44］。前人已有研究證明，Treg 細(xì)胞中叉頭盒蛋白3（FoxP3）去甲基化與誘導(dǎo)食物過敏的免疫耐受有關(guān)，對于產(chǎn)生免疫耐受的患者其去甲基化水平更高［45-46］。而該項(xiàng)研究亦創(chuàng)新性地引入FoxP3 的去甲基化率作為判斷LGG 影響CMPA 患兒免疫進(jìn)程的重要結(jié)局指標(biāo)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CMPA 患兒在應(yīng)用混合LGG 的配方奶粉后其FoxP3 的去甲基化水平更高且更快，證實(shí)了LGG在誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫耐受上的獨(dú)特作用。

4 小 結(jié)

CMPA 是兒童時期最常見的過敏性疾病之一，其可引起包括皮疹、胃腸道、呼吸道以及嚴(yán)重全身過敏癥狀。CMPA 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未明確，其內(nèi)因涉及遺傳基因多態(tài)性，外因則與腸道菌群失衡等有關(guān)，而益生菌LGG 治療CMPA 的相關(guān)機(jī)制及其生物療效亦需更進(jìn)一步的驗(yàn)證。就現(xiàn)有研究證據(jù)而言，LGG 具有緩解CMPA 過敏癥狀，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)及促進(jìn)機(jī)體免疫耐受等諸多優(yōu)點(diǎn)，可作為一種輔助治療CMPA的藥物。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。