王東帥， 師丹陽， 金 敏

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津市環(huán)境與食品安全風(fēng)險監(jiān)控技術(shù)重點實驗室，天津，300050)

自從17世紀Leeuwenhoek使用自制顯微鏡發(fā)現(xiàn)微生物以來，經(jīng)過幾個世紀的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了八大類幾萬種微生物。傳統(tǒng)微生物研究方法以分離培養(yǎng)純菌為主，但99%以上〔1〕的原核微生物因培養(yǎng)技術(shù)有限而無法得到。20世紀90年代后期興起的微生物基因組學(xué)研究，從對微生物完整的全基因核苷酸測序入手，在分析基因結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，認識微生物的完整生物學(xué)功能。使用微生物基因組學(xué)研究方法，將從本質(zhì)上揭示和分析大量迄今未被認識的微生物新的基因，以及它們所編碼的具有新功能的蛋白質(zhì)和新的基因調(diào)控元件，從而進一步研究微生物相互之間、微生物與環(huán)境之間的關(guān)系。 微生物基因組學(xué)提供了一種新的微生物研究方法，但傳統(tǒng)的一、二代測序技術(shù)對微生物完整的全基因核苷酸測序方面存在較多缺陷，第三代測序技術(shù)因其超長測序讀長、直接測序、快速測序等特點，推動了微生物基因組學(xué)發(fā)展。

1 納米孔測序技術(shù)簡介

1.1 測序技術(shù)的發(fā)展1953年，Watson、Crick發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，人類對于遺傳信息的研究深入到分子層面，為探究隱藏在基因內(nèi)部的生物學(xué)信息，基因測序技術(shù)飛速發(fā)展。以Sanger雙鏈終止法〔2〕為代表的第一代測序技術(shù)，開創(chuàng)了生命科學(xué)研究中的基因組學(xué)時代。雖然第一代測序技術(shù)優(yōu)點明顯(精度達99.999%、讀長達1000-1500bp)，但其高成本和低通量限制了其大規(guī)模應(yīng)用。21世紀初，以瑞士羅氏(Roche)的454〔3〕、美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)的SOLID〔4〕和美國因美納(Illumina)的Solexa、Hiseq〔5〕等測序儀器為代表的第二代測序技術(shù)(Next-Generation Sequencing Technology，NGS)大幅壓縮了測序成本和測序時間，使得基因測序成功進入高通量測序時代。但是第二代測序技術(shù)存在著儀器昂貴、讀長短(250-300bp)、PCR擴增易引入錯配堿基等缺點，無法滿足人們對于全基因組測序的需求。第三代測序技術(shù)以單分子測序為特點，完美解決了上述問題，其代表有美國太平洋生物科學(xué)(PacBio)的SMRT(Single-molecule Real-time sequencing)技術(shù)和英國牛津納米孔(ONT)的Nanopore技術(shù)。相對于前兩代測序技術(shù)，第三代測序技術(shù)具有高效、高通量、長讀長等特點，被認為是測序技術(shù)的發(fā)展方向〔6〕，促進了微生物基因組學(xué)的研究發(fā)展。

1.2 納米孔測序技術(shù)原理納米孔測序技術(shù)的本質(zhì)是利用電信號進行測序〔7〕。在一層高電阻率的薄膜上鑲嵌大量蛋白質(zhì)構(gòu)成的納米孔(nanopore)，薄膜兩側(cè)浸沒于離子溶液中，在膜兩側(cè)電壓作用下，離子通過納米孔從一側(cè)移動到另一側(cè)產(chǎn)生電流。對核酸分子測序時，薄膜上的接頭將待測序核酸分子引入馬達蛋白，馬達蛋白具有解螺旋和限制核酸分子通過速度兩種功能，并能與納米孔的通道蛋白結(jié)合，待測核酸分子解鏈形成單鏈分子穿過納米孔。由于四種堿基的空間構(gòu)象不同，通過納米孔時會產(chǎn)生不同的離子流波動，通過分析離子流波動峰值就能判斷出對應(yīng)的堿基，實現(xiàn)高速實時測序。

1.3 納米孔測序技術(shù)特點納米孔測序技術(shù)是根據(jù)待測核酸分子通過納米孔引起的電流信號波動而進行測序，因此原則上其測序長度沒有限制〔8〕，最新文獻記載的最大讀長達到了2.2M〔9〕，為全基因組測序提供了可能。同時，納米孔測序可以直接對DNA或RNA進行測序〔10, 11〕，無需對樣品進行PCR擴增或逆轉(zhuǎn)錄，不僅節(jié)約了操作時間，也降低了測序成本。此外，納米孔測序設(shè)備簡單，ONT開發(fā)的MinION測序儀重量不足100g，僅需連接電腦就能開始測序工作，且測序文庫簡單易制備，具有極佳的便攜性，可在極地〔12〕、叢林〔13〕、海洋〔14〕甚至太空〔15〕等各種地點完成實時測序，使研究工作不再局限于傳統(tǒng)實驗室。然而納米孔測序也存在總體測序錯誤率高的缺點(約為11%〔16〕)，主要是由插入和刪除堿基引起，但其測序錯誤隨機發(fā)生，可通過增加覆蓋度來降低錯誤率，經(jīng)糾正后的測序正確率可達99.8%〔8〕。

2 納米孔測序技術(shù)在微生物基因組學(xué)研究中的應(yīng)用

2.1 環(huán)境微生物種群分布的快速識別在微生物組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，已有參考基因組的微生物數(shù)量遠低于自然界存在的微生物數(shù)量，這是因為過去的微生物研究方法多依賴于單菌種純化培養(yǎng)，2006年Sabet等〔17〕在北美的Mono湖中發(fā)現(xiàn)大量無法培養(yǎng)的微生物，揭示出以往微生物研究存在著盲區(qū)。納米孔測序無需對微生物進行培養(yǎng)，可對環(huán)境中所有微生物的全基因組進行測序，為微生物研究開辟了新的路徑。Nicholls等〔18〕針對納米孔測序技術(shù)制定出了微生物菌群標準數(shù)據(jù)集，能通過比對樣本環(huán)境的測序結(jié)果，實現(xiàn)特定環(huán)境微生物種群分布的快速識別。利用此項技術(shù)，Hamner等〔19〕對美國蒙大拿州一條河流中的微生物病原體進行了快速檢測，該研究結(jié)果展示了納米孔測序技術(shù)未來應(yīng)用于公共衛(wèi)生監(jiān)測的廣闊前景。

2.2 微生物種屬的精準鑒定16S和18S rRNA基因分別存在于所有原核和真核生物的基因組中，16S/18S rRNA基因是目前研究微生物系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的最常用的分子標記〔20〕，其高變區(qū)能反映出微生物間的進化差異，對16S/18S rRNA分析就能實現(xiàn)不同微生物種屬的分類鑒定。傳統(tǒng)二代測序因讀長短，往往只能獲得1-2段高變區(qū)域，納米孔測序技術(shù)的長讀長能實現(xiàn)高變區(qū)域的全長測序，實現(xiàn)混合微生物群落中微生物種屬的精確鑒定。Moon等〔21〕將納米孔16S擴增子測序應(yīng)用于臨床診療中，從細菌性腦膜炎患者腦脊液中快速鑒定出了細菌種類，針對性應(yīng)用抗生素，提高了治療效果。Kai等〔22〕利用16S rRNA基因分析的測序方法，構(gòu)建出一套臨床致病微生物快速檢測流程，提高了臨床檢測效率。此外，納米孔測序技術(shù)還能對RNA病毒直接測序，無需進行逆轉(zhuǎn)錄，Wongsurawat等〔10〕建立了一種RNA直接測序方案，能同時檢測多種RNA病毒。Kafetzopoulou等〔23〕利用納米孔測序技術(shù)，在2018年尼日利亞爆發(fā)的拉薩熱中快速識別了致病病毒分型，有效指導(dǎo)了疫情的處置。納米孔測序技術(shù)的微生物種屬鑒定簡單易操作，未來檢測技術(shù)會因此發(fā)生質(zhì)的飛躍。

2.3 微生物遺傳信息功能區(qū)的定位解析要深入研究微生物遺傳信息不同區(qū)域的功能，就必須完整表征出微生物的基因組。研究表明〔24〕，微生物基因組中的高重復(fù)區(qū)域和高GC區(qū)域?qū)τ诶斫馄浠蚪M功能至關(guān)重要，但傳統(tǒng)二代測序讀長短，組裝后基因組中常存在很多缺口。納米孔測序技術(shù)的長讀長能實現(xiàn)基因組的無偏倚組裝〔8〕，從而更好地分析微生物遺傳信息各區(qū)域的不同功能。Somerville等〔25〕發(fā)現(xiàn)，僅使用短讀長的Illumina法進行基因組組裝時容易遺漏較多區(qū)域，而具有長讀長特點的第三代測序技術(shù)能有效覆蓋遺漏區(qū)域。利用納米孔測序的長讀長序列組裝和二代測序技術(shù)的短讀長序列糾錯，既能保證基因序列的完整性，又能保證其準確性，為深入研究微生物遺傳信息不同區(qū)域的功能創(chuàng)造了條件。Moss等〔26〕開發(fā)的Lathe測序流程，結(jié)合了長讀組裝和短讀糾錯功能，在混合菌群實驗和人類糞便實驗中均較好的實現(xiàn)了細菌基因組組裝，可研究基因組中重復(fù)區(qū)域在微生物功能中的作用。

2.4 微生物基因組轉(zhuǎn)錄本的功能探究轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在RNA水平上研究基因表達的情況，是研究細胞表型和功能的重要手段。納米孔測序技術(shù)的長讀長能夠?qū)θLRNA轉(zhuǎn)錄本進行直接測序，既減少了測序時間，也提高了測序準確率，有助于微生物群落的基因表達研究。Jenjaroenpun等〔27〕對RNA直接測序，對包括非翻譯區(qū)(UTR)在內(nèi)的RNA全長轉(zhuǎn)錄本進行了測序，還鑒定了許多聚腺苷酸化非編碼RNA，包括rRNA、端粒酶RNA和長鏈非編碼RNA，為深入研究微生物轉(zhuǎn)錄本提供了方法。Bolisetty等〔28〕發(fā)現(xiàn)納米孔測序技術(shù)能克服外顯子距離過大時短讀長出現(xiàn)的連接性問題，可以對選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本實現(xiàn)精確解析，全長比對的平均一致性達到了90%以上。Zhang等〔29〕依據(jù)環(huán)狀RNA與線性mRNA相似性特點，使用納米孔測序技術(shù)開發(fā)出了CIRI-long方法，通過確定一種能夠表現(xiàn)出特殊的剪接和表達模式的新型內(nèi)含子自連接環(huán)狀RNA，實現(xiàn)了無偏倚的重建全長環(huán)狀RNA序列，為研究轉(zhuǎn)錄本的功能開創(chuàng)了新的途徑。隨著轉(zhuǎn)錄本研究的不斷深入，RNA直接測序?qū)蔀槲磥怼巴暾蚪M時代”轉(zhuǎn)錄組分析的一項多功能工具。

2.5 微生物基因組修飾堿基的識別分析幾乎所有微生物基因組都涉及堿基修飾，研究微生物基因組的修飾堿基對于深入了解微生物遺傳信息有著重要意義，修飾堿基能通過影響基因表達來影響表觀遺傳信息。傳統(tǒng)測序技術(shù)的測序過程需要進行核酸擴增，進而會刪除堿基修飾，納米孔測序不需要擴增或鏈合成，可以直接檢測到單個堿基修飾，為修飾堿基的功能檢測提供了條件。Rand等〔30〕利用納米孔測序技術(shù)繪制出了胞嘧啶和腺嘌呤的甲基化圖譜框架，能夠有效定位出微生物堿基修飾中的甲基化位點。Simpson等〔11〕通過MinION量化了DNA堿基修飾的電流信號強度，實現(xiàn)了5-甲基胞嘧啶(5-mC)的快速檢測。Tourancheau等〔31〕集合了大量細菌數(shù)據(jù)構(gòu)建出了微生物甲基化檢測標準數(shù)據(jù)集，能夠?qū)ξ⑸锘蚪M甲基化快速鑒定，為研究微生物基因組修飾堿基的功能提供了條件。

3 未來的展望

近年來，微生物基因組學(xué)研究成為生命科學(xué)研究的一個熱點，而對微生物基因組學(xué)的深入研究和認識得益于測序技術(shù)的快速發(fā)展。納米孔測序技術(shù)的出現(xiàn)實現(xiàn)了很多技術(shù)上的突破：(1)全基因組測序無需對微生物進行純化和培養(yǎng)，使微生物種群分布檢測更加簡單、全面；(2)直接的RNA測序，不僅能快速實現(xiàn)RNA病毒的檢測，也可以依托16S/18S rRNA靶向測序?qū)崿F(xiàn)微生物種屬快速鑒定；(3)直接RNA測序還能實現(xiàn)微生物轉(zhuǎn)錄本直接測序研究，為研究微生物基因表達開辟了新途徑；(4)超長讀長使微生物基因檢測更加連貫，更容易發(fā)現(xiàn)微生物遺傳信息序列中的功能區(qū)，為基因組功能區(qū)的定位和解析創(chuàng)造條件；(5)全長測序可以避免核酸擴增，能夠直接對基因組堿基修飾進行測序分析，為表觀遺傳學(xué)研究提供了方法。

然而，納米孔測序仍然存在一些局限性，如堿基錯誤率高和生物信息軟件不足等。雖然納米孔測序的錯誤率很高，但是通過增加覆蓋度(30X或更高)能夠明顯降低錯誤率，糾正后錯誤率由11%〔16〕可降至0.2%以下〔8〕。此外，納米孔測序技術(shù)常與傳統(tǒng)的第二代測序技術(shù)結(jié)合使用，即利用納米孔測序讀全，利用第二代測序校準，提高測序準確性。另一個重要限制因素是生物信息軟件不夠豐富，納米孔測序數(shù)據(jù)的計算需要大量的數(shù)據(jù)存儲和計算成本。近年來，大量新技術(shù)應(yīng)用到測序數(shù)據(jù)分析中來，新的下游校正軟件、變量調(diào)節(jié)軟件、可視化工具等，都有效提高了數(shù)據(jù)處理能力〔32〕，進一步提高了測序的準確性〔33〕。

相信在不久的將來，納米孔測序技術(shù)的應(yīng)用范圍和應(yīng)用規(guī)模會越來越大，基于納米孔測序技術(shù)的微生物基因組學(xué)研究能夠獲得更高質(zhì)量的基因測序結(jié)果，進而促進人們對生命科學(xué)的進一步了解，推動公共衛(wèi)生和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的全面發(fā)展。