諶愛華，王妙華，廖鑫，吳天唯，曹晨曦，鄧凱文

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

缺血性腦卒中指各種原因所致的腦部血液供應障礙，導致腦組織缺血缺氧壞死，出現(xiàn)相應的神經(jīng)功能缺損癥狀，是當前危及人們生命健康的三大主要疾病之一，具有高病發(fā)率、高病死率、高復發(fā)率的特點［1-2］。為研究缺血性腦卒中的發(fā)病機制及篩選有效治療方案，提高缺血性腦卒中的治愈率，實驗動物研究成為首選。常用的動物包括大鼠、小鼠、兔等，大鼠因腦血管解剖與人類相近，且具有成本低、繁殖快的優(yōu)點，故被選為制備腦缺血模型的最常用動物［3］。建立大鼠腦缺血模型方法多樣，如光化學法、線栓法、電凝法、三氯化鐵法，其中線栓法以不開顱、效果肯定、可準確控制缺血時間等優(yōu)勢而被廣泛應用［4］。筆者在運用線栓法復制大鼠大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型時，將遇到的問題做如下闡述。

1 大鼠的選取

1.1 大鼠的品系缺血性腦卒中模型常用的大鼠品系主要有Sprague-Dawley大鼠、Wistar大鼠、Long-Evans大鼠等。大腦中動脈缺血后，不同品系大鼠腦部梗死區(qū)域面積及穩(wěn)定性不一。與Sprague-Dawley大鼠比較，Wistar大鼠血管變異率高，Long-Evans大鼠造模后缺血面積較小甚至無梗死［5］。研究顯示，Sprague-Dawley大鼠頸部血管較為清晰，易于手術(shù)，且大腦中動脈變異小，腦缺血后梗死面積一致性高，故Sprague-Dawley大鼠為目前最常用的腦梗死模型［6-7］。

1.2 大鼠的體質(zhì)量大鼠年老后其動脈硬化、管腔狹窄、血管彈性變差，血管脆性增加，造模時易損傷血管，增加模型的病死率，故選用青壯年大鼠。研究表明，體質(zhì)量為260～300 g的大鼠最適宜做腦缺血模型［8］，體質(zhì)量過小，其對麻醉藥物的耐受性差，術(shù)后病死率高；體質(zhì)量過大，血管增粗且變異增加，線栓難以充分阻斷血流，梗死區(qū)域難以形成，導致成功率低［9］。筆者通過造模操作發(fā)現(xiàn)，體質(zhì)量在260～300 g的大鼠頸總動脈相對較粗，剪切口時不易破壞血管而線栓更易穿入，較易控制腦梗死面積，而體質(zhì)量超過300 g的大鼠，血管分叉更多，在分離血管時易將頸外動脈及其分支錯認為頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，直接影響模型的成功率。

1.3 大鼠的性別流行病學表明，絕經(jīng)后女性患腦梗死的比率與男性大致相當，可能與絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素水平降低導致神經(jīng)保護作用缺損有關(guān)［10-11］。故在研究腦梗死方面，不應忽視雌激素的作用，大鼠亦是如此。研究表明，雌激素可拮抗興奮性氨基酸毒性、抑制炎癥反應、抵抗氧化應激反應［12-13］。實驗研究也顯示，雌性MCAO模型大鼠在病死率方面顯著低于雄性MCAO大鼠，雌激素具有周期性，且具有神經(jīng)保護作用［14］，故MCAO模型常用雄性大鼠。

2 造模操作

2.1 術(shù)前的準備大鼠購至實驗室后，需適應性喂養(yǎng)1周，正常飲食、飲水，保持實驗室溫度在25～30℃，晝夜溫差保持在3℃以內(nèi)，注意檢查鼠籠的密封性及送風系統(tǒng)正常與否，勤換墊料。關(guān)于術(shù)前是否需要禁食。研究顯示，高血糖可增加大鼠腦缺血損傷，故多數(shù)觀點表明需要術(shù)前禁食12 h，不禁水［15］；另有研究表明，術(shù)前禁食會導致低血糖，低血糖也會導致大鼠病死率增加［16］。至于結(jié)果如何，可在實驗中進一步摸索。

2.2 麻醉劑的選擇麻醉是決定手術(shù)成敗、動物存活與否的關(guān)鍵，目前常用的實驗動物麻醉劑包括氯胺酮、烏拉坦、戊巴比妥鈉、水合氯醛、異氟烷等。其中，氯胺酮麻醉起效快，但持續(xù)時間短，約10～20 min，能較大程度地抑制大鼠呼吸［17］；烏拉坦通過與膽堿酯酶結(jié)合達到麻醉的作用，雖麻醉效果穩(wěn)定，但對大鼠平均動脈壓及血液黏稠度有較大影響［18］；戊巴比妥鈉麻醉時可引起動物強烈的四肢痙攣、強直，對體溫及呼吸的抑制較明顯［19］；水合氯醛起效時間短，但維持時間較長，對動物的呼吸頻率、體溫及心率的影響較戊巴比妥鈉小，同時價格低廉、原料易得等優(yōu)點［20］；異氟烷麻醉比較穩(wěn)定，對腦溫影響較小，但價格較貴。綜合以上，制備腦缺血模型時常選用的麻醉藥物為水合氯醛，濃度為10%，按0.30 mL·100 g-1給藥，故注射麻醉藥前需準確稱量大鼠的體質(zhì)量，為提高大鼠術(shù)后存活率，可先注射總劑量的4／5，如果麻醉不完全，可每次加注0.1 mL，補充麻醉藥物時應避免過量注射，否則會導致大鼠因呼吸衰竭而死亡。麻醉時一般采用腹腔注射，需將針頭放置于低位，使腹部臟器及腸管下移，針頭以45°角經(jīng)右下腹部斜刺入腹腔［21］，針刺深度不宜過深，避免刺傷臟器及腸管導致腸穿孔、腸麻痹等并發(fā)癥，從而影響實驗結(jié)果。

2.3 手術(shù)切口的選擇手術(shù)切口主要選擇大鼠頸部正中或者頸部正中偏左側(cè)或右側(cè)，然而頸部正中切口易損傷氣管。研究表明，大鼠左側(cè)的迷走神經(jīng)直接分布于心臟，選擇頸部左側(cè)切口時，對心臟影響較大，導致術(shù)后病死率升高［22］，故造模時盡量選擇頸部正中偏右側(cè)頸總動脈搏動處切口，隨后逐步分開皮膚與淺筋膜，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌之間的肌間隙，避免破壞肌纖維，在靠近氣管處尋找頸總動脈，仔細分離頸總動脈及迷走神經(jīng)，再向頸總動脈遠心端分離尋找三岔口，鈍性分離出頸內(nèi)動脈及頸外動脈。為方便視野暴露及減輕操作風險，操作過程中可佩戴頭燈。

2.4 線栓的選擇制作線栓的材料包括鼠須、尼龍線、釣魚線等。TANG Q等［23］把單股尼龍線一端加熱，燒成直徑略大于線栓本身的球形頭端，可充分阻斷大腦中動脈血流，減輕對血管壁的機械性損傷。制作球形頭端后，還可在線栓前端表面涂以物質(zhì)（石蠟、硅膠、多聚賴氨酸等）進行包被［24］。筆者通過實驗發(fā)現(xiàn)，以石蠟覆蓋頭端穩(wěn)定性欠佳，反復多次插入線栓時易出現(xiàn)石蠟脫落等情況。采用梭形頭端與圓形頭端進行比較發(fā)現(xiàn)，前者造成的梗死面積較后者大，且梗死變異率較低［25］，為制備線栓提供了新方向。對尼龍線包被材料進行觀察發(fā)現(xiàn)，在牙用樹脂、聚賴氨酸和硅酮3種包被材料中，以硅酮效果最佳［26］。結(jié)合價格及模型穩(wěn)定性考慮，筆者實驗時采用北京西濃公司生產(chǎn)的多聚賴氨酸包被的線栓。為降低線栓進入翼腭動脈的概率，需讓線栓有一弧度。研究表明，260～300 g大鼠選用線栓最佳直徑為0.25～0.28 mm，插入長度為18～22 mm［27］，具體深度宜視大鼠大小而定，可在距線栓頭端18 mm處用作一標記，以便明晰線栓插入深度。

2.5 線栓入顱的部位及深度線栓的插入方法包括3種［28］：①由頸外動脈經(jīng)頸內(nèi)動脈向大腦中動脈插線；②經(jīng)頸內(nèi)動脈向大腦中動脈插線；③從頸總動脈經(jīng)頸內(nèi)動脈向大腦中動脈插線。經(jīng)頸外動脈向頸內(nèi)動脈插入線栓，操作時間長，且頸外動脈較細，線栓易錯入翼腭動脈，因頸內(nèi)動脈較細，操作時易損傷血管，致操作時間延長，操作時需盡可能暴露較長的頸內(nèi)動脈，這樣可增加對大鼠的損傷［29］。故筆者實驗時采用線栓由頸總動脈進入，但若行再灌注操作，拔出線栓后其供血只能由另外一側(cè)腦血管經(jīng)大腦環(huán)供血，也為其缺點。經(jīng)實踐發(fā)現(xiàn)，線栓進入顱過程并非時時順利，需要多加耐心，多次重復插入，過程中需用力應柔和，以免致血管斷裂，線栓插入深度為（18±1）mm。固定線栓后即可進行縫合，若只需要復制腦缺血模型時，可將多余的線栓剪掉藏于體內(nèi)，如需再灌注時，可將線栓尾端暴露于體外，用標記筆或標簽紙進行標記。

2.6 注意事項因久置、光照、高溫均可使水合氯醛分解，故麻醉藥物應現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存，配麻醉藥時盡量用蒸餾水，減少其他因素的干擾。因大鼠血管較細，故手術(shù)中需仔細謹慎，分離血管及迷走神經(jīng)時注意鈍性分離，避免因手術(shù)不當而致血管破裂或迷走神經(jīng)斷裂，導致大鼠創(chuàng)傷性死亡。術(shù)后易出現(xiàn)傷口感染，操作時需保證無菌設施及無菌操作，每次實驗前均需對手術(shù)器械及線栓、麻醉藥等進行滅菌或消毒處理。術(shù)中出血量多，易造成大鼠因休克而亡，造模后可視出血情況酌情補充生理鹽水。術(shù)后大鼠因麻醉尚未完全清醒，大鼠體溫較低，需要注意保暖。研究表明，造模成功后進行保溫措施有助于增加造模成功率［30］，由于條件限制，具體實驗時可用燈泡照射維持大鼠體溫，或在大鼠表面鋪上一層干凈墊料。

2.7 術(shù)中、術(shù)后并發(fā)癥及處理方式術(shù)中、術(shù)后并發(fā)癥主要包括麻醉過量死亡、感染、大出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血。出現(xiàn)感染主要是由于造模時不注重無菌操作所致，可于造模完成后腹腔注射青霉素G 20～30萬單位，傷口縫合后可外擦適量青霉素抗感染。大出血的主要原因為插線栓時剪口過大，牽扯時用力過猛，致血管斷裂，此時須立即夾閉血管斷端，將頸總動脈遠心端的備用活線在斷端處打死結(jié)，再在頸總動脈上剪一小口，故第一次剪口時，應盡量靠近頸總動脈近心端。也有可能因線栓進入頸內(nèi)動脈后所受阻力太大，用力過度，戳破血管，導致蛛網(wǎng)膜下腔出血，影響顱內(nèi)血管微循環(huán)而亡，故操作時注意用力柔和，插線栓遇阻力時需保持心態(tài)平和，改變方向或重新插入。分離血管及迷走神經(jīng)時，損傷神經(jīng)亦會導致呼吸衰竭、心臟驟停，故鈍性分離血管及神經(jīng)時需仔細謹慎。

3 體會

線栓法制備腦缺血模型效果肯定，為實驗室建立腦缺血模型的常用方法。動物品種及年齡的選擇、麻醉劑選用、線栓處理及入顱深度、術(shù)后護理等因素均可影響造模成功率。復制成功的腦缺血模型，操作者需要仔細謹慎、熟悉大鼠解剖結(jié)構(gòu)、提高手術(shù)熟練度，線栓入顱的部位及深度為影響造模成功的關(guān)鍵因素，不同研究者對線栓入顱的深度各有見解，筆者認為正式實驗之前可行預實驗研究，對所需品種及年齡的大鼠進行不同入顱深度測試，對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分及采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑法對腦缺血梗死面積進行檢測，獲得最合適的線栓插入深度。對于造模失敗的動物，應對其進行尸體解剖，一方面可了解大鼠的死亡原因，另一方面也可對大鼠的解剖進一步熟悉，為正式實驗提供經(jīng)驗。手術(shù)結(jié)束后24～48 h為大鼠存活的關(guān)鍵時期，如何能在這段時間提高大鼠存活率也是需要解決的問題。總之，用線栓法制備腦缺血模型前，需設想實驗中遇到的多種可能情況及各個環(huán)節(jié)對模型的影響，參考相關(guān)文獻對問題進行探索；實驗時，提高造模者手術(shù)熟練程度及盡量避免破壞血管等；術(shù)后，對大鼠進行護理，可提高模型復制成功率，為后期實驗奠定基礎(chǔ)。