林 曼， 許 莉， 張 燕， 黃翠燕， 方金華， 溫海燕

?？谑袐D幼保健院 婦產(chǎn)科，海南 海口 570203

對孕婦進行有效的產(chǎn)前診斷、預(yù)防染色體異?；翁撼錾莾?yōu)生優(yōu)育的重要任務(wù)[1]。目前，我國主要應(yīng)用的染色體核型檢測手段為介入性診斷，包括絨毛活檢和羊水穿刺，但介入性產(chǎn)前診斷具有一定的創(chuàng)傷性，使流產(chǎn)率和胎兒致畸率升高[2]。游離胎兒DNA(free fetal DNA，cffDNA)在孕5周時即可被檢出。有研究發(fā)現(xiàn)，cffDNA檢測有利于成功篩查13、18、21-三體綜合征[3]。本研究旨在探討cffDNA檢測對高危產(chǎn)婦胎兒染色體異常的診斷價值?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取海口市婦幼保健院自2018年1月至2019年6月收治的2 623例產(chǎn)前檢查單胎妊娠孕婦為研究對象。孕婦及其家屬均簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 高風(fēng)險篩查 超聲儀(美國GE公司Voluson E型號)檢測胎兒頸部透明層厚度；抽取孕婦血液，在2 h內(nèi)進行血清分離，檢測血清β-人絨毛膜促性腺激素水平和妊娠相關(guān)血漿蛋白A濃度。通過分析孕婦的基線資料(年齡、孕周、體質(zhì)量、吸煙史等)及檢測的胎兒頸部透明層厚度、血清β-人絨毛膜促性腺激素水平、妊娠相關(guān)血漿蛋白A濃度，采用中位數(shù)倍數(shù)法，進行風(fēng)險值計算分析，分析軟件為MultiCalc 2000，風(fēng)險截斷值為1：270。篩選出高危孕婦，給予其絨毛活檢和cffDNA檢測。

1.3 絨毛活檢 腹部超聲指導(dǎo)下，導(dǎo)管通過孕婦子宮口或腹部，穿刺取胚胎絨毛部，約20～30 mg，將取出的絨毛部組織立即置于無菌生理鹽水中，顯微鏡下觀察，取優(yōu)質(zhì)部分用手術(shù)刀切碎成糊狀，移入離心管中，加入1 ml胰蛋白酶消化5 min，3 000 r/min離心10 min，棄上清，1640培養(yǎng)液吹打均勻后，放入孵箱中培養(yǎng)，待克隆體形成較好后，進行染色體核型檢測。

1.4 cffDNA檢測 抽取孕婦10 ml靜脈血，置于含有EDTA的抗凝管中，2 h內(nèi)進行血漿提取，4℃、3 000 r/min離心10 min，離心半徑為15 cm，吸取上清液，移入離心管中，再次4℃、3 000 r/min離心10 min，離心半徑為15 cm，留取上清液，置于-80℃冰箱中保存。用QIAamp DNA Blood Mini Kit血液DNA提取試劑盒提取400 μl血漿，獲得DNA 50 μl DNA溶液，將所得DNA樣品置于-20℃下保存待測。設(shè)計引物序列DYS14F：5β-GGGCCAATGTTGTATCCTTCTC-3′；設(shè)計引物序列DYS14R：5β-GCCCATCGGTCACTTACACTTC-3′；探針序列：5β-(FAM)TCTAGTGGAGAGGTGCTC(TAMRA)-3′(上海賽默飛世爾科技有限公司)。引物置于-20℃保存。采用Rotor Gene 3000 FQ-PCR儀對提取的樣品溶液DNA進行擴增，Qubit文庫進行定量，上機測序。采用BWA map軟件對測序得到序列與人類基因組參考序列進行比對，用Z值估量樣本數(shù)據(jù)，Z值>3時為異常。

2 結(jié)果

經(jīng)過高風(fēng)險篩查，2 623例孕婦中，125例診斷為高危產(chǎn)婦，因其中的23例孕婦需在孕15周后行羊水穿刺檢查、2例孕婦為Rh陰性血型，最終100例孕婦同時接受了絨毛活檢和cffDNA檢測。100例孕婦平均年齡(28.65±2.64)歲，平均體質(zhì)量(131.43±6.72)kg，平均孕周(12.34±2.67)周，4例有既往不良妊娠史。絨毛活檢中：32例染色體異常，包括21-三體綜合征10例、18-三體綜合征10例、45，XO 12例；68例未見異常。cffDNA檢測中：30例染色體異常，包括21-三體綜合征10例、18-三體綜合征8例、45，XO 12例；70例未見異常。以絨毛活檢為“金標(biāo)準(zhǔn)”，cffDNA檢測的敏感度為93.75%(30/32)，特異度為100.00%(68/68)。

3 討論

cffDNA幾乎全部來自于胎盤滋養(yǎng)層細胞[5]，其在孕5周時即可被檢出[4]，隨著孕周的增加而增加，且在分娩2 h后迅速消失，不影響下一胎檢測，因此，cffDNA被認為是無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的最優(yōu)檢測指標(biāo)之一[6]。有研究報道，在329例孕婦中，cffDNA檢測出了全部的25例13-三體綜合征，以及37例18-三體綜合征中的34例，因此，檢測母體血漿中的cffDNA作為孕早期非介入性產(chǎn)前檢查手段十分可行[7-9]。本研究結(jié)果顯示：以絨毛活檢為“金標(biāo)準(zhǔn)”，cffDNA檢測的敏感度為93.75%(30/32)，特異度為100.00%(68/68)，敏感度和特異度均較高。但cffDNA檢測也存在一些不足：(1)方法復(fù)雜，失敗率高，需要保證研究中的樣本儲存環(huán)境和操作步驟嚴格符合要求[10]；(2)孕婦孕周和體質(zhì)量指數(shù)的增加會導(dǎo)致母體脂肪組織脫落，使血漿cffDNA升高，造成假陽性結(jié)果[11]；(3)費用昂貴，給孕婦及家庭造成經(jīng)濟壓力[12]。

綜上所述，cffDNA檢測對21-三體綜合征、18-三體綜合征、45，XO等染色體異常疾病的診斷敏感度和特異度均較高，在孕早期進行此項檢測可降低染色體異常畸形胎兒妊娠率。