程引 張治國(guó)

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700

在整個(gè)生命周期中，骨骼為保持其結(jié)構(gòu)和功能的完整性，需要不斷地進(jìn)行重建活動(dòng)。在成年人的骨骼中，每年更換原有骨骼的5 %到10 %[1]。骨重建活動(dòng)主要由主導(dǎo)骨吸收的破骨細(xì)胞(osteoclasts，OC)和主導(dǎo)骨形成的成骨細(xì)胞(osteoblasts，OB)介導(dǎo)，并受多種細(xì)胞因子、激素、生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)[2-3]。各種因素直接或間接影響骨重建，導(dǎo)致骨吸收/骨形成失衡，是骨代謝相關(guān)疾病的典型特征。其中骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種代謝性骨骼疾病，以骨量降低、骨微觀結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征，是骨吸收/骨形成失衡典型例子[4]。有研究[5]表明，年齡50歲及以上的人群，約有三分之一的女性和五分之一的男性會(huì)因骨質(zhì)疏松癥而發(fā)生骨折，尤其是髖部骨折具有高致殘率和致死率[6]。隨著人類微生物組學(xué)研究的不斷深入，腸道微生物對(duì)于健康和疾病的影響成為熱點(diǎn)，而腸道微生物與骨代謝的關(guān)系也受到越來越多研究者的關(guān)注[7-9]。

“微生物組”(microbiome)一詞由諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Josh Lederberg最先提出，是指微生物、微生物基因組以及它們?cè)谔囟ōh(huán)境中的相互作用的集合[10]。腸道微生物(gut microbiota，GM)是人體中數(shù)量最多、種類最豐富和作用機(jī)制最復(fù)雜的微生物群，也是目前與機(jī)體疾病關(guān)聯(lián)研究最多的微生物群。研究顯示，GM與炎癥性腸病[11]、結(jié)直腸癌[12]、肥胖[13]、糖尿病[14]、骨質(zhì)疏松癥[7-9]等相關(guān)，甚至可能成為抗菌素耐藥基因的儲(chǔ)存庫[15]。Ohlsson等[16]提出“骨微生物學(xué)”(osteomicrobiology)概念，以強(qiáng)調(diào)二者密切的相互關(guān)系，認(rèn)為GM可能通過改變?nèi)砑肮撬璧拿庖郀顟B(tài)調(diào)節(jié)OC生成進(jìn)而影響骨代謝，并指出GM可能成為治療OP和預(yù)防骨折的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

既往關(guān)于GM影響骨代謝的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)主要基于三種模式，給予益生菌和/或益生元干預(yù)，使用廣譜抗生素治療，以及在無菌條件下培養(yǎng)[17]。益生菌被定義為在給予足夠量時(shí)對(duì)健康有益的活性微生物[18]，而益生元是促進(jìn)有益微生物生長(zhǎng)和/或促進(jìn)微生物代謝物質(zhì)有益變化的不可消化的可發(fā)酵食品成分[19]。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究論述了益生菌/益生元補(bǔ)充劑可通過改變腸道菌群狀態(tài)影響骨代謝，且在多種益生菌菌株和不同疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中得到證實(shí)[20-22]。本文結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)試從調(diào)節(jié)免疫功能、腸上皮屏障功能、短鏈脂肪酸代謝產(chǎn)物等幾個(gè)方面闡述益生菌/益生元影響骨代謝的機(jī)制。

1 調(diào)節(jié)免疫功能

前人的研究證實(shí)，GM可在生理或疾病狀態(tài)下通過CD4+T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)骨生成或骨量丟失，從而影響小鼠的骨量[23-24]。由于GM數(shù)量龐大、種類龐雜，對(duì)于其具體作用機(jī)制的闡述尚不充分，然而越來越多的研究證明益生菌/益生元可能是GM調(diào)節(jié)骨量的主要機(jī)制之一[25]。

Ohlsson等[26]從小鼠去卵巢前2周開始，給其飲用副乳桿菌DSM13434和副乳桿菌DSM13434、植物乳桿菌DSM-15312、DSM-15313的混合制劑，6周后發(fā)現(xiàn)這些益生菌均改變了小鼠的免疫狀態(tài)，抑制了去卵巢(ovariectomized，OVX)誘導(dǎo)的骨吸收。Britton等[27]以12周齡的OVX小鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)治療能夠抑制CD4+T淋巴細(xì)胞的增加和腫瘤壞死因子信號(hào)的分泌從而抑制OC的產(chǎn)生，阻止了OVX誘導(dǎo)的RANKL水平的增加，也降低了破骨細(xì)胞標(biāo)志物TRAP5 mRNA水平。Collins等[28]使用Rag1基因敲除(缺乏成熟T和B淋巴細(xì)胞)小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同樣發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞在介導(dǎo)L.reuteri6475抑制骨量丟失中起著關(guān)鍵作用；用腸系膜淋巴結(jié)和CD3+T細(xì)胞進(jìn)行的體外研究發(fā)現(xiàn)，L.reuteri6475以濃度依賴的方式增加IL-10和干擾素γ的表達(dá)；其分泌的因子還可增強(qiáng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子Osterix的表達(dá)。T細(xì)胞各亞型都能夠影響骨細(xì)胞，尤其是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells，Treg)和輔助性T細(xì)胞17(Th17細(xì)胞)，Treg細(xì)胞抑制OC生成，Th17細(xì)胞誘導(dǎo)OC生成，二者的動(dòng)態(tài)平衡在人體內(nèi)各種炎癥條件下十分重要[29]。研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus，LA)可升高OVX小鼠體內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)量，降低Th17細(xì)胞數(shù)量，通過調(diào)節(jié)Treg-Th17細(xì)胞平衡增加骨量；此外，LA還可抑制促進(jìn)骨吸收的細(xì)胞因子(IL-6、IL-17、RANKL、TNF-α)表達(dá)，并誘導(dǎo)抑制骨吸收的的細(xì)胞因子(IL-10和IFN-γ)表達(dá)，進(jìn)而防止OVX導(dǎo)致的骨量丟失[30]。這些研究表明益生菌/益生元通過影響免疫功能或抑制骨吸收、或促進(jìn)骨形成、或二者兼之，最終起到調(diào)節(jié)骨代謝，延緩OP發(fā)生發(fā)展的作用。

2 調(diào)節(jié)腸道上皮屏障功能

腸上皮屏障功能受損是GM介導(dǎo)繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。腸上皮是宿主和腸道微生物之間的屏障，腸道通過細(xì)胞旁間隙控制腸腔和上皮黏膜下層之間的分子運(yùn)輸。在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞旁間隙阻止半徑大于1.5 nm的分子通過[31]。病理情況下，如OVX小鼠性激素缺乏可導(dǎo)致腸道縫隙連接蛋白(如Claudin 2、3和以及JAM3)等分子的轉(zhuǎn)錄水平降低，腸道通透性增加從而造成骨量丟失[32]。而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)益生菌/益生元在維持腸道屏障功能，預(yù)防骨質(zhì)疏松癥方面有著令人驚喜的效果。

Li等[21]的研究發(fā)現(xiàn)無菌(germ free，GF)小鼠性激素缺乏不會(huì)導(dǎo)致骨量丟失，說明了GM在介導(dǎo)骨量丟失中的重要作用。而常規(guī)喂養(yǎng)的去勢(shì)小鼠被分別飼喂鼠乳糖李桿菌(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)和VSL#3TM后，可導(dǎo)致腸道通透性降低，延緩去卵巢引起的骨量丟失。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，普通小鼠經(jīng)抗生素干預(yù)導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡，腸道通透性顯著增加，引發(fā)骨小梁破壞和骨量丟失；經(jīng)飼喂L.reuteri可降低抗生素治療后厚壁菌/擬桿菌的比例，防止腸上皮屏障破壞，并減少股骨和椎骨小梁的骨量丟失[33]。益生菌/益生元除降低腸道通透性、改變腸道菌群比例外，還可通過其他通路調(diào)節(jié)腸上皮屏障功能，預(yù)防OP發(fā)生。如提高腸上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)分子水平[34]；調(diào)控腸上皮黏膜表觀遺傳及礦物質(zhì)吸收信號(hào)通路[35]。

3 調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸代謝

短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)是由食物中不可消化的碳水化合物(主要是膳食纖維)經(jīng)腸道細(xì)菌發(fā)酵而產(chǎn)生。現(xiàn)有研究表明，SCFAs通過多種作用機(jī)制影響骨代謝過程，如直接抑制OC分化[36]，通過Treg細(xì)胞促進(jìn)OB分化[37]以及降低腸道pH值促進(jìn)鈣的吸收[38]等。腸道中SCFAs的類型和含量不僅取決于所攝取食物纖維的類型和腸道消化食物的持續(xù)時(shí)間，還取決于腸道微生物群的組成和活性，如乙酸由許多類型的細(xì)菌產(chǎn)生的，而丙酸和丁酸只由有限的幾種細(xì)菌產(chǎn)生[39-40]。益生元/益生菌主要通過改變腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)SCFAs的含量和類型，從而影響骨代謝。

Tyagi等[41]給予常規(guī)飼養(yǎng)的10周齡雌性小鼠口服LGG 4周，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充LGG不僅改變腸腔內(nèi)微生物多樣性，還可增加梭狀芽孢桿菌的比例，使小腸組織和血清中丁酸水平升高，骨形成標(biāo)志物也隨之增加。另一項(xiàng)研究表明，低聚果糖(fructo-oligosaccharide，F(xiàn)OS)和低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)等益生元增加動(dòng)物骨密度的機(jī)制主要是調(diào)節(jié)腸道中雙歧桿菌的比例，從而提高SCFAs的含量以及有效成分的利用度[42]。Rodrigues等[43]的研究結(jié)果佐證了這一觀點(diǎn)，F(xiàn)OS或長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum，B.longum)喂養(yǎng)大鼠4周后，大鼠盲腸總厭氧菌數(shù)、盲腸重量、盲腸內(nèi)及外周血丙酸濃度以及骨質(zhì)量、骨強(qiáng)度均高于對(duì)照組。雖然補(bǔ)充不同種類的益生菌/益生元發(fā)酵后產(chǎn)生不同類型、不同濃度的SCFAs[44]，但其最終都可正向調(diào)節(jié)骨代謝，促進(jìn)骨吸收/骨形成平衡，有效防治OP。

4 其他機(jī)制

既往諸多研究已證實(shí)，益生菌/益生元在礦物質(zhì)代謝中起到重要作用。無論在生理或病理狀態(tài)下，益生菌/益生元均可增強(qiáng)嚙齒動(dòng)物和人類的鈣吸收[45]；菊粉提高骨礦質(zhì)含量的作用在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中均得到了證實(shí)[46]；經(jīng)FOS干預(yù)的胃切除大鼠鈣吸收增加[47]；菊糖和果寡糖都可增加OVX大鼠的鈣吸收[48]；雪蓮果粉和長(zhǎng)雙歧桿菌喂養(yǎng)的大鼠脛骨鈣、磷、鎂含量顯著高于對(duì)照組，從而起到預(yù)防OP的作用[43]。另外，研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)雙歧桿菌可以通過上調(diào)SPARC和BMP-2基因的表達(dá)來促進(jìn)成骨過程，增加骨密度[49]。

益生菌/益生元調(diào)節(jié)骨代謝機(jī)制見表1。

表1 益生菌/益生元調(diào)節(jié)骨代謝機(jī)制Table 1 The regulatory mechanism of probiotics and prebiotics in bone metabolism

5 展望

骨微生物學(xué)是指有關(guān)微生物和微生物群在健康和疾病中的作用以及微生物群調(diào)節(jié)出生后骨發(fā)育、骨老化和病理性骨量丟失的機(jī)制的調(diào)查[16]。腸道微生物作為人體最大的微生物群體，在既往研究中大多采用兩類方法研究其對(duì)骨代謝的作用，①調(diào)節(jié)微生物數(shù)量(通過抗生素干預(yù)或使用無菌小鼠)；②調(diào)節(jié)微生物種類(通過添加益生元或益生菌)。由于腸道微生物群的個(gè)體間差異較大，益生菌的來源、數(shù)量、種類、功能也難以一致，且以往大多數(shù)研究都基于動(dòng)物模型，若要設(shè)計(jì)進(jìn)行規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)、成規(guī)模的臨床研究具有一定難度。

本文從調(diào)節(jié)免疫功能、調(diào)節(jié)腸上皮屏障功能、調(diào)劑短鏈脂肪酸代謝等方面綜述了益生菌/益生元影響骨代謝的機(jī)制。不難發(fā)現(xiàn)這些機(jī)制之間有一定關(guān)聯(lián)，同一種益生菌可能發(fā)揮不同的功能，同一機(jī)制也可由不同的益生菌介導(dǎo)。在未來，除進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)篩選菌株和探索相關(guān)機(jī)制，多菌株的聯(lián)合使用以實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)骨代謝功能的優(yōu)化應(yīng)是一個(gè)研究方向。