易 玲，黃志翔，譚 濤，向雅香

湖南省岳陽(yáng)市中心血站，湖南岳陽(yáng) 414000

紅細(xì)胞血型系統(tǒng)在輸血技術(shù)學(xué)中具有重要意義，目前已發(fā)現(xiàn)人類紅細(xì)胞有36種血型系統(tǒng)，360種血型抗原[1]。紅細(xì)胞血型系統(tǒng)具有高度的遺傳多態(tài)性，不同民族和地區(qū)存在差異[2]。本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-序列特異性引物法(PCR-SSP法)對(duì)Duffy、Dombrock、Diego、Kidd 4種紅細(xì)胞血型系統(tǒng)8個(gè)抗原基因進(jìn)行分型，分析岳陽(yáng)地區(qū)漢族人群血型抗原基因頻率和多態(tài)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)留取本血站2019年12月303份非血緣關(guān)系岳陽(yáng)籍、漢族、ABO血型不限、RhD(+)固定獻(xiàn)血者5 mL EDTA抗凝全血標(biāo)本。年齡18～55歲，男131名，女172名。本研究經(jīng)無(wú)償獻(xiàn)血者知情同意。

1.2儀器與試劑 儀器：離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))；凝膠成像儀(Bio-Rad公司，美國(guó))；PCR儀(Life technologies公司，美國(guó))。試劑:EX-DNA Kit(天津TIANLONG公司，批號(hào):E0819040131);人類Kidd(Jka/Jkb)、Duffy(Fya/Fyb)、Diego(Dia/Dib)、Dombrock(Doa/Dob)血型系統(tǒng)抗原基因分型檢測(cè)試劑(天津吉諾泰普生物技術(shù)有限公司，批號(hào):E20191009)。

1.3方法

1.3.1樣本DNA提取 按TIANLONG EX-DNA Kit試劑說(shuō)明書提取全血基因組DNA。

1.3.2PCR擴(kuò)增及電泳 按照按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR-SSP法擴(kuò)增。Kidd(Jka/Jkb)、Duffy(Fya/Fyb)、Diego(Dia/Dib)、Dombrock(Doa/Dob)血型系統(tǒng)PCR循環(huán)參數(shù):96 ℃預(yù)變性2 min;96 ℃ 20 s,68 ℃ 60 s,5個(gè)循環(huán);96 ℃ 20 s,65 ℃ 45 s,72 ℃ 30 s,10 個(gè)循環(huán);96 ℃ 20 s,62 ℃ 45 s,72 ℃ 30 s,15個(gè)循環(huán);72 ℃延長(zhǎng) 2 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用2.5%瓊脂糖凝膠于電壓140～150 V條件下電泳10～15 min,采用自動(dòng)凝膠圖像分析儀成像并記錄電泳結(jié)果。

1.3.3PCR-SSP法結(jié)果判定 每個(gè)PCR反應(yīng)都產(chǎn)生強(qiáng)弱不一的1 009 bp內(nèi)對(duì)照產(chǎn)物。根據(jù)有無(wú)PCR產(chǎn)物及產(chǎn)物長(zhǎng)度按表1指定相應(yīng)血型基因。在相應(yīng)堿基對(duì)位置觀察有無(wú)特異性條帶，若出現(xiàn)特異性條帶判讀為陽(yáng)性，未出現(xiàn)則判斷為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。按基因計(jì)數(shù)法計(jì)算基因頻率，計(jì)算觀察值和期望值，采用χ2檢驗(yàn)分析基因分布是否符合Hardy-Weinberg平衡法則，按參考文獻(xiàn)[3]計(jì)算抗原不配合率。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1岳陽(yáng)漢族人群紅細(xì)胞血型系統(tǒng)抗原基因型及基因頻率 Duffy、Dombrock、Diego和Kidd血型系統(tǒng)抗原基因頻率具有多態(tài)性，其血型系統(tǒng)對(duì)偶抗原不配合率分別為0.095 0、0.142 3、0.047 0和0.374 6。采用χ2檢驗(yàn)比較基因型分布的觀察值和期望值，各血型系統(tǒng)的P>0.05，符合Hardy-Weinberg平衡法則。見表2。

表1 紅細(xì)胞血型分型試劑盒PCR引物及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

表2 岳陽(yáng)漢族人群紅細(xì)胞血型系統(tǒng)抗原基因型和基因頻率

2.2岳陽(yáng)漢族人群與其他地區(qū)、民族人群血型系統(tǒng)等位基因多態(tài)性比較 見表3～6。

表3 Duffy血型系統(tǒng)等位基因在中國(guó)不同地區(qū)、民族人群中的分布

續(xù)表3 Duffy血型系統(tǒng)等位基因在中國(guó)不同地區(qū)、民族人群中的分布

表4 Dombrock血型系統(tǒng)等位基因在中國(guó)不同地區(qū)、民族人群中的分布

續(xù)表4 Dombrock血型系統(tǒng)等位基因在中國(guó)不同地區(qū)、民族人群中的分布

表5 Digeo血型系統(tǒng)等位基因在中國(guó)不同地區(qū)、民族人群中的分布

表6 Kidd血型系統(tǒng)等位基因在中國(guó)不同地區(qū)、民族人群中的分布

3 討 論

紅細(xì)胞血型系統(tǒng)在臨床輸血中具有重要意義，也是人類的重要遺傳標(biāo)志，每個(gè)人的紅細(xì)胞選擇性表達(dá)其中一部分血型抗原。目前臨床輸血主要關(guān)注ABO、Rh血型系統(tǒng)，對(duì)Duffy、Diego、Dombrock、Kidd血型系統(tǒng)關(guān)注較少，即臨床輸血大多執(zhí)行的ABO、Rh血型系統(tǒng)相配合，其他血型系統(tǒng)相容性的原則，這對(duì)第1次輸血的患者影響不大，但對(duì)需多次輸血的患者則影響很大[16]。臨床對(duì)多次輸血的患者進(jìn)行交叉配血和不規(guī)則抗體篩選時(shí)，常有交叉配血不合現(xiàn)象發(fā)生，發(fā)現(xiàn)有抗-Jkb、抗-Dia、抗-Dob、抗-Fya等不規(guī)則抗體[17-18]，甚至還有由抗-Fyb、抗-Jkb、抗-Ce聯(lián)合抗體引起的溶血性輸血反應(yīng)的個(gè)例報(bào)道[19]。這給輸血帶來(lái)極大麻煩，往往短時(shí)間內(nèi)難以找到合適的獻(xiàn)血者，危及患者的生命。因此，了解一個(gè)地區(qū)人群多種紅細(xì)胞血型系統(tǒng)基因頻率分布特點(diǎn)，對(duì)指導(dǎo)臨床科學(xué)合理用血，特別是需要反復(fù)輸血的患者的用血安全具有重要意義。

有研究發(fā)現(xiàn)，岳陽(yáng)漢族人群的Duffy、Dombrock、Diego、Kidd血型系統(tǒng)抗原基因頻率具有多態(tài)性，Dombrock血型系統(tǒng)的Doa/Dob、Kidd血型系統(tǒng)的Jka/Jkb對(duì)偶抗原不配合率較高，分別為0.142 3、0.374 6，這些血型系統(tǒng)的個(gè)體因隨機(jī)輸血或妊娠，產(chǎn)生同種抗體的概率也較高，再次輸血時(shí)易引起溶血性輸血反應(yīng)或存在交叉配血難以找到相容性血液的風(fēng)險(xiǎn)，再次妊娠時(shí)易發(fā)生新生兒溶血病[20]。

本研究結(jié)果顯示，岳陽(yáng)漢族人群的Duffy、Dombrock、Diego、Kidd血型系統(tǒng)抗原基因頻率的多態(tài)性與我國(guó)其他地區(qū)漢族和少數(shù)民族相比，大部分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，僅岳陽(yáng)漢族人群的Duffy血型系統(tǒng)與山西運(yùn)城漢族人群差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Dombrock血型系統(tǒng)與西藏藏族、新疆哈薩克族差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與哈爾濱滿族差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Duffy血型系統(tǒng)與新疆哈薩克族差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與西藏藏族、哈爾濱滿族差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Diego、Kidd血型系統(tǒng)與新疆哈薩克族、西藏藏族、哈爾濱滿族差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示不同血型系統(tǒng)在我國(guó)的不同民族、不同地區(qū)人群中分布存在著共性和個(gè)性。

隨著輸血技術(shù)學(xué)的發(fā)展，如何使臨床精準(zhǔn)輸血、最大限度地避免免疫性輸血不良反應(yīng)，從而達(dá)到科學(xué)合理、效果更好是輸血技術(shù)研究的重要方向[21]。對(duì)固定獻(xiàn)血者檢測(cè)多種紅細(xì)胞血型系統(tǒng)、建立獻(xiàn)血者血型基因信息庫(kù)，對(duì)稀有血型患者選擇配合型血液輸注具有重要意義。

本研究初步建立了岳陽(yáng)地區(qū)多種紅細(xì)胞血型系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)，充實(shí)了國(guó)家稀有血型獻(xiàn)血者數(shù)據(jù)庫(kù)，為臨床精準(zhǔn)輸血提供了保障。