王 偉，趙四林，范伏元，金朝暉，李 妲，符 艷

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pul-monary disease，COPD)簡(jiǎn)稱慢阻肺，是一種常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，COPD的發(fā)病機(jī)制除了與炎性反應(yīng)、氧化與抗氧化失衡等有關(guān)外，還與細(xì)胞凋亡有關(guān)[1]。Ⅱ 型肺泡上皮細(xì)胞(type Ⅱ alveolar epithelial cells，AEC Ⅱ )是肺泡上皮細(xì)胞的干細(xì)胞，AEC Ⅱ 的異常凋亡在COPD發(fā)病過(guò)程中起重要作用，降低AEC Ⅱ 凋亡可能是治療COPD的一種途徑。研究顯示，miR-199a-5p在COPD患者肺組織中表達(dá)升高，可能參與COPD的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[2]。但miR-199a-5p對(duì)型肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響還尚不清楚，因此本實(shí)驗(yàn)用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)大鼠 Ⅱ 型肺泡上皮細(xì)胞凋亡，研究miR-199a-5p對(duì) Ⅱ 型肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制，以期為COPD的分子治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料:選取2017年4月至2018年12月于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的45例COPD患者，男性23例，女性22例，年齡47～71歲，平均年齡(60.4±6.8)歲。COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2013版《慢性阻塞性肺疾病診斷指南》。排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性腫瘤患者；心臟、腎等重要器官功能不全者；急慢性炎性反應(yīng)疾病患者；自身免疫疾病患者。另選取同時(shí)期45名健康體檢者，男性21例，女性24例，年齡45～70歲，平均年齡(60.6±6.9)歲。兩組患者年齡、性別等一般資料無(wú)差異。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意(1811017)，患者自愿簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 細(xì)胞和試劑:大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系(AECⅡ)(上?？吕咨锟萍加邢薰?；DMEM培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V(annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細(xì)胞凋亡試劑盒和雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)； 卷曲受體4(frizzled receptor 4,FZD4)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白 (Bcl-2-associated X protein，Bax)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(北京中杉金橋生物試劑公司)；miR-199a-5p模擬物及模擬對(duì)照序列(miR-NC)、miR-199a-5p抑制劑(anti-miR-199a-5p)及抑制劑陰性對(duì)照序列(anti-miR-NC)、FZD4的小干擾RNA(si-FZD4)及亂序無(wú)意義陰性序列(si-NC)(廣州銳博生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與分組：復(fù)蘇AECⅡ細(xì)胞，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖匯合至80%～90%時(shí)，進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。將AECⅡ分為對(duì)照組(control)、LPS組(100 ng/mL LPS)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-199a-5p抑制劑陰性對(duì)照序列)、anti-miR-199a-5p組(轉(zhuǎn)染miR-199a-5p抑制劑)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-199a-5p模擬物對(duì)照序列)、miR-199a-5p組(轉(zhuǎn)染miR-199a-5p模擬物)、anti-miR-199a-5p+LPS組(轉(zhuǎn)染miR-199a-5p抑制劑后用100 ng/mL LPS培養(yǎng))、anti-miR-NC+LPS組(轉(zhuǎn)染miR-199a-5p抑制劑陰性對(duì)照序列后用100 ng/mL LPS培養(yǎng))、anti-miR-199a-5p+si-FZD4+LPS組(同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-199a-5p抑制劑與FZD4小干擾RNA后用100 ng/mL LPS培養(yǎng))和anti-miR-199a-5p+si-NC+LPS組(同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-199a-5p抑制劑與FZD4亂序無(wú)意義陰性序列后用100 ng/mL LPS培養(yǎng))。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)miR-199a-5p和FZD4 mRNA表達(dá)：Trizol試劑提取患者血清或細(xì)胞中總RNA，定量后按試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后按PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列miR-199a-5p上游5′-GTCGATACCAGTGCGT GTCGTCGTGTCGGC-3′，下游5′-AATTGCACTGGATA CGACAGCCTAT-3′；FZD4上游5′-CCTCGGCTACAAC GTGACC-3′，下游5′-TGCACATTGGCACATAAACAG A-3′；U6上游5′-CTGGTAGGGTGCTCGCTTCGGCAG-3′，下游5′-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′；GAPDH上游5′-GCCACATCGCTCAGACACC A-3′，下游5′-CT CAGCCTTGACGGTGCCAT-3′。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-199a-5p相對(duì)于U6、FZD4、GAPDH相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，PBS清洗2次，用結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞。依次加入10 μL annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中FZD4、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)：用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量。蛋白樣品變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至聚偏乙烯二氟(PVDF)膜，封閉，加入FZD4(1∶500)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過(guò)夜；加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑，成像后用Image J軟件分析目的蛋白條帶吸光度值，以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.5 miR-199a-5p與FZD4靶向關(guān)系驗(yàn)證：1)Target Scan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，F(xiàn)ZD4的3′UTR與miR-199a-5p的核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建FZD4野生型和突變型雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(FZD4-WT)和(FZD4-MUT)。分別將miR-199a-5p模擬物與FZD4-WT(miR-199a-5p+ FZD4-WT組)、模擬物對(duì)照序列與FZD4-WT(miR-NC+FZD4-WT組)、miR-199a-5p模擬物與FZD4-MUT(miR-199a-5p+FZD4-MUT組)、模擬物對(duì)照序列與FZD4-MUT(miR-NC+FZD4-MUT組)共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后參照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)熒光素酶活性。2)anti-miR-199a-5p組、anti-miR-NC組、miR-199a-5p組和miR-NC組細(xì)胞分別接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后，Western blot檢測(cè)FZD4蛋白表達(dá)水平，方法同1.2.4。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 COPD患者血清中miR-199a-5p和FZD4 mRNA表達(dá)水平

與對(duì)照比較，COPD患者血清中miR-199a-5p表達(dá)水平升高(1.93±0.13vs1.04±0.09)(P<0.05)，而FZD4 mRNA表達(dá)水平降低(0.30±0.05vs1.03±0.09)(P<0.05)。

2.2 LPS對(duì)AECⅡ細(xì)胞中miR-199a-5p和FZD4表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，LPS組AECⅡ中miR-199a-5p的表達(dá)水平升高(P<0.05)，F(xiàn)ZD4 的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)(圖1)。

2.3 下調(diào)miR-199a-5p對(duì)LPS誘導(dǎo)的AECⅡ細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，LPS組miR-199a-5p表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率和Bax表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與anti-miR-NC+LPS組和LPS組比較，anti-miR-199a-5p+LPS組miR-199a-5p表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率和Bax表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(圖2)。

A.the effect of LPS on the expression of miR-199a-5p in AEC Ⅱ cells; B.the effect of LPS on the expression of FZD4 mRNA in AEC Ⅱ cells; C.the effect of LPS on the expression of miR-199a-5p and FZD4 protein in AEC Ⅱ; *P<0.05 compared with control group

A.the effect of down-regulating miR-199a-5p on apoptosis rate of LPS-induced AECⅡ cells; B.the effect of down-regulating miR-199a-5p on the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax in LPS-induced AECⅡ cells; *P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with anti-miR-NC+LPS group；△P<0.05 compared with LPS group

2.4 miR-199a-5p靶向負(fù)調(diào)控FZD4表達(dá)

TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，F(xiàn)ZD4的3′UTR與miR-199a-5p的核苷酸序列存在結(jié)合位點(diǎn)。與miR-NC+FZD4-WT組比較，miR-199a-5p+FZD4-WT組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-199a-5p組FZD4表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-199a-5p組FZD4表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖3，4)。

A.the binding site of the 3′UTR of FZD4 and the nucleotide sequence of miR-199a-5p; B.the result of dual luciferase activity detection; *P<0.05 compared with miR-NC+FZD4-WT group圖3 miR-199a-5p靶向結(jié)合FZD4Fig 3 miR-199a-5p targets binding to FZD4

*P<0.05 compared with anti-miR-NC group; #P<0.05 compared with miR-NC group圖4 miR-199a-5p對(duì)AEC Ⅱ細(xì)胞中FZD4蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Effect of miR-199a-5p on the protein expression of FZD4 in AEC Ⅱ cells

2.5 下調(diào)FZD4表達(dá)降低miR-199a-5p對(duì)LPS誘導(dǎo)的AECⅡ細(xì)胞凋亡的影響

與anti-miR-199a-5p+si-NC+LPS組比較，anti-miR-199a-5p+si-FZD4+LPS組FZD4蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，凋亡率和Bax表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(圖5)。

3 討論

COPD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，肺泡上皮細(xì)胞等肺組織細(xì)胞凋亡增加[3]，抑制肺組織細(xì)胞凋亡對(duì)于COPD的預(yù)防和治療具有重要意義。AECⅡ是肺泡上皮細(xì)胞的干細(xì)胞，參與肺泡更新和損傷修復(fù)，調(diào)節(jié)肺泡液體量和成分。研究表明，miR-199a-5p參與COPD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。如文獻(xiàn)[4]報(bào)道稱，miR-199a-5p在急性加重期COPD患者血清中表達(dá)水平顯著高于健康人群，其高表達(dá)與GOLD分級(jí)、mMRC分級(jí)相關(guān)。此外，COPD患者肺組織中miR-199a-5p表達(dá)水平也升高[5]，且還有研究報(bào)道m(xù)iR-199a-5p可能參與COPD患者機(jī)體內(nèi)Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫平衡[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，COPD患者血清中miR-199a-5p表達(dá)水平顯著升高。此外，本研究還顯示，LPS可促進(jìn)AECⅡ中細(xì)胞miR-199a-5p的表達(dá)，下調(diào)miR-199a-5p表達(dá)后，LPS誘導(dǎo)的AEC Ⅱ細(xì)胞凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax蛋白表達(dá)降低，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是凋亡相關(guān)的重要分子，Bcl-2表達(dá)增加可抑制細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)ax表達(dá)增加則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示下調(diào)miR-199a-5p表達(dá)可有效抑制LPS誘導(dǎo)的AECⅡ細(xì)胞凋亡。

生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，F(xiàn)ZD4的3′UTR與miR-199a-5p的核苷酸序列存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)，F(xiàn)ZD4可能是miR-199a-5p的靶基因。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-199a-5p可靶向調(diào)控FZD4。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)下調(diào)AECⅡ中miR-199a-5p表達(dá)后，F(xiàn)ZD4蛋白表達(dá)升高，而上調(diào)miR-199a-5p表達(dá)后，F(xiàn)ZD4蛋白表達(dá)降低，進(jìn)一步說(shuō)明miR-199a-5p在AECⅡ中細(xì)胞靶向負(fù)調(diào)控FZD4表達(dá)。FZD4是Wnt信號(hào)通路上一個(gè)7次跨膜受體分子，參與組織損傷修復(fù)。研究報(bào)道COPD患者肺組織和原代肺泡上皮Ⅱ型細(xì)胞中FZD4呈低表達(dá)，低表達(dá)降低導(dǎo)致肺泡修復(fù)能力受損[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，COPD患者血清中FZD4 mRNA表達(dá)水平顯著降低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。且LPS誘導(dǎo)的AECⅡ細(xì)胞中FZD4的mRNA和蛋白表達(dá)降低，提示FZD4參與COPD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究還顯示，下調(diào)FZD4表達(dá)可降低下調(diào)miR-199a-5p表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的AECⅡ細(xì)胞凋亡的抑制作用，提示下調(diào)miR-199a-5p表達(dá)通過(guò)上調(diào)ZD4表達(dá)來(lái)抑制LPS誘導(dǎo)的AECⅡ細(xì)胞凋亡。

A.the effect of down-regulating FZD4 and miR-199a-5p on apoptosis rate of LPS-induced AECⅡ; B.the effect of down-regulating FZD4 and miR-199a-5p on the expression of apoptosis-related proteins FZD4, Bcl-2 and Bax in LPS-induced AECⅡ; *P<0.05 compared with anti-miR-199a-5p+si-NC+LPS group

綜上所述，下調(diào)miR-199a-5p表達(dá)可有效抑制LPS誘導(dǎo)的AECⅡ細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與上調(diào)FZD4表達(dá)有關(guān)，miR-199a-5p/FZD4軸可能為COPD的治療提供了新靶點(diǎn)。