孫添怡，劉 帆，仇文穎，馬 超

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 人體解剖與組織胚胎學(xué)系，北京 100005)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，起病隱匿，進(jìn)展緩慢，患病率正逐年上升，目前缺乏有效的治療手段[1-2]。piRNA(PIWI-Interacting RNA)是一種發(fā)現(xiàn)僅10余年的非編碼小RNA，長(zhǎng)度為24～32個(gè)核苷酸[3]。最初在小鼠和大鼠的生殖細(xì)胞中鑒定出piRNA與PIWI蛋白相互作用形成一種RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，在沉默轉(zhuǎn)座過(guò)程、調(diào)節(jié)基因表達(dá)等方面發(fā)揮生物學(xué)功能[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)piRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可能影響AD的核心病理生理過(guò)程，在β-淀粉樣蛋白-42(amyloid β-protein 42, Aβ42)的異常生成、tau的分裂和翻譯后標(biāo)記、Aβ42和tau的清除受損等方面發(fā)揮作用[6]?；谇捌谘芯砍晒?，本實(shí)驗(yàn)選取經(jīng)預(yù)測(cè)與AD相關(guān)性高的10個(gè)在人腦中表達(dá)的piRNA[7]，比較AD組和對(duì)照組中這些piRNA及其相關(guān)mRNA的表達(dá)差異，從而探索與AD相關(guān)的piRNA。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 腦組織樣本:本實(shí)驗(yàn)所用的人腦組織都來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院的國(guó)家發(fā)育和功能人腦組織資源庫(kù)(National Human Brain Bank For Development and Functions)。所有大腦樣本均根據(jù)中國(guó)人腦組織庫(kù)協(xié)作聯(lián)盟2019年發(fā)布的中國(guó)人腦庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程采集[8]。所有捐獻(xiàn)者均已簽署知情同意書。本研究由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：009-2014)。

1.1.2 試劑：Agilent RNA 6000 Kit(Agilent)，snRNA cDNA Kit、snRNA PCR Kit、mRNA cDNA Kit、mRNA PCR Kit(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 腦組織病理染色及評(píng)分和分組：按照NIH-AA發(fā)布的AD神經(jīng)病理評(píng)估指南推薦的染色及評(píng)分方法[9]，對(duì)腦組織石蠟切片進(jìn)行ABC病理染色并評(píng)分，ABC病理染色包括Aβ染色、p-tau染色和Garvey銀染染色。根據(jù)Aβ斑塊、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)炎性斑塊分布及數(shù)量對(duì)19例人腦進(jìn)行AD的ABC評(píng)分:“無(wú)(None，N)”“低(Low，L)”“中(Immediately，IM)”“高(High，H)”。染色后將樣本分為兩組，AD組10例，對(duì)照組9例。

1.2.2 Real-time PCR檢測(cè)piRNA及相關(guān)mRNA：取冰凍保存的前額葉組織約200 mg加入1 mL Trizol試劑，研磨成勻漿后加入0.2 mL氯仿劇烈振蕩，靜置后12 000 r/min離心15 min，取上清加入0.5 mL異丙醇，12 000 r/min離心10 min后棄上清，向沉淀中加入1 mL 75%乙醇輕輕混勻，750 r/min離心5 min后棄上清，晾干RNA樣本后加入適量無(wú)核酸酶水溶解得到RNA溶液。

根據(jù)Agilent RNA 6000合成試劑盒說(shuō)明書組裝芯片，將65 μL的膠和1 μL的染料混合，避光室溫13 000 r/min離心10 min，將混合物按說(shuō)明書吹入RNA芯片標(biāo)記G的孔，RNA樣品1 μL吹入樣品孔中，DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1 μL吹入ladder孔中。振蕩后將芯片放入Agilent 2100生物分析儀中檢測(cè)腦組織樣本RNA完整性(RNA integrity number，RIN)。檢測(cè)后得到合格樣本13例，AD組6例，對(duì)照組7例進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)snRNA cDNA試劑盒說(shuō)明書把從人腦組織中提取的非編碼小RNA加poly(A)尾，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)snRNA RT-qPCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行real-time PCR(RT-qPCR)反應(yīng)，反應(yīng)體系：2×qPCR Mixture 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、piRNA cDNA 3 μL、無(wú)核酸酶水稀釋到20 μL。Biorad CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，過(guò)程如下：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 1 min，變性、退火、延伸40個(gè)循環(huán)后停止反應(yīng)。

根據(jù)mRNA cDNA試劑盒說(shuō)明書把從人腦組織中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)mRNA RT-qPCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)12 μL、上游引物(10 μmol/L)1 μL、 下游引物(10 μmol/L)1 μL、 cDNA 2 μL、無(wú)核酸酶水稀釋到25 μL。Biorad CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，過(guò)程如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后停止反應(yīng)。引物序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人腦樣本的篩選及RNA質(zhì)量評(píng)價(jià)

經(jīng)AD病理評(píng)分，染色例圖(圖1)，評(píng)分結(jié)果及樣本背景信息(表2)。

19例腦樣本RNA濃度區(qū)間范圍是245～1 080 mg/L，A260/280區(qū)間范圍是1.83～2.28，RIN值區(qū)間范圍是2.8～7.7(表3)。將RIN ≥6.0視為合格樣本，其中13例腦組織標(biāo)本合格，含AD組6例，對(duì)照組7例。瓊脂糖凝膠電泳中13例合格樣本RNA顯示了清晰的條帶(圖2A，B)，6例不合格樣本條帶不清晰(圖2A，C)。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

A.the arrow pointing at amyloid β deposits; B.the arrow pointing at neurofibrillary tangles; C.the arrow pointing at neuritic plaques; A-C.AD group; D-F.aging control group; A&D.Aβ staining; B&E.P-tau staining; C&F.garvey staining

表2 AD組及對(duì)照組詳細(xì)樣本信息

表3 AD及對(duì)照組RIN值檢測(cè)結(jié)果

A.agarose gel electrophoresis detection, number 1 to 13 represented qualified samples, a to f represented unqualified samples(n=19); B.Kurtosis curve of RIN value of qualified sample; C.Kurtosis curve of RIN value of unqualified sample

2.2 piRNA在AD患者和對(duì)照人群腦組織中表達(dá)

選取的10個(gè)piRNA 均出現(xiàn)AD組表達(dá)量降低的趨勢(shì)(表4)，其中4個(gè)piRNA DQ597973、DQ576872、DQ597479和DQ600318在AD組表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(圖3)。

2.3 DQ600318相關(guān)的mRNA LRRC37A3在AD患者和對(duì)照人群腦組織中表達(dá)

LRRC37A3在AD組為0.76±0.12，較對(duì)照組的1.47±0.42顯著降低(P<0.01)(圖4)。

表4 AD及對(duì)照組RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

piRNA在人腦中含量豐富，可能是導(dǎo)致AD的危險(xiǎn)因素之一，在小樣本的篩選中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其不可忽視的潛在作用[10]。本文對(duì)10個(gè)piRNA進(jìn)行檢測(cè)，均表現(xiàn)為AD組表達(dá)量降低，提示piRNA表達(dá)量降低可能與AD相關(guān)。其中有3個(gè)piRNA出現(xiàn)的變化趨勢(shì)與參考文獻(xiàn)相同，其余相反，產(chǎn)生原因可能是二者檢測(cè)方法不同，文獻(xiàn)中采用測(cè)序法而本文選擇RT-qPCR法，并且人腦的個(gè)體差異較大，不同樣本間差異明顯，在增大樣本量后可能得出可信度更高的結(jié)果。

大腦中piRNA的生物發(fā)生模式為核定位[11]，位于基因內(nèi)或來(lái)自基因間區(qū)域的piRNA可能調(diào)節(jié)鄰近基因的mRNA穩(wěn)定性和翻譯[12]。研究確定的AD相關(guān)piRNA中，41%富集在蛋白質(zhì)編碼基因，表明這些piRNA序列是對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因的補(bǔ)充或接近[7]，這些piRNA極可能通過(guò)序列互補(bǔ)性來(lái)靶向調(diào)節(jié)鄰近的基因[13]。其中DQ600318位于17號(hào)染色體60、325、632-60、325、657，LRRC37A3位于17號(hào)染色體62、850、486-62、914、903，二者在染色體上位置接近，推測(cè)LRRC37A3表達(dá)可能受DQ600318表達(dá)的調(diào)控。

DQ600318與LRRC37A3分別在TOMM40-rs2075650以及ApoE-rs4420638兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)出現(xiàn)明顯差異[7]。歐洲人腦TOMM40-rs2075650可能增加AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[14]，而ApoEε 4又是公認(rèn)的癡呆最大風(fēng)險(xiǎn)因子[15]。因此推測(cè)DQ600318和LRRC37A3可能是AD相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因，對(duì)DQ600318的檢測(cè)或許會(huì)是AD新的檢測(cè)標(biāo)記。

Independent sample t test, *P<0.05, **P<0.01compared with control group;AD group (n=6)； control group (n=7); A.DQ600318(P<0.01); B.DQ597479; C.DQ597973; D.DQ576872

AD group (n=6); control group (n=7); A.DQ581610; B.DQ590835; C.DQ571669; D.DQ586404; E.DQ586113; F.DQ571030圖4 無(wú)差異的6個(gè)piRNA在AD及對(duì)照組表達(dá)Fig 4 No significant differential expression was shown in 6 piRNAs compared with control