劉世鵬，江林春， 韋潔敏， 白尚尚，崔浪軍

(1.延安大學生命科學學院，陜西 延安 716000；2.西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，陜西師范大學生命科學學院，西安 710119)

金銀花(Lonicerajaponica)又名二花，花初開為白色，后轉為黃色，因此得名金銀花。忍冬最早出現(xiàn)于東晉葛洪著于《肘后備急方》[1]，“金銀花”一名出自《本草綱目》[2]，首次以金銀花入藥記載于《救荒本草》[2]。藥材金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬及同屬植物干燥花蕾或帶初開的花[3]，為傳統(tǒng)大宗藥材之一，其性味甘寒，氣味芳香，入肺經、心經和胃經[4]，具有清熱解毒、廣譜抗菌、通經活絡等功效。傳統(tǒng)意義上金銀花具有清熱解毒、疏散風熱等功效，臨床上用于治療溫病發(fā)熱、風熱感冒、咽喉腫痛、肺炎、丹毒、蜂窩狀組織炎、病疾等多種疾病[5]，屬于中醫(yī)臨床上清熱解毒的首選藥物?，F(xiàn)代研究表明，金銀花主要含有揮發(fā)油類、黃酮類和有機酸類等成分，具有解熱抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利膽等作用[6]，其中含有的綠原酸是抗菌消炎的主要有效成份，對金黃葡萄球菌、溶血性鏈球菌、痢疾球菌、肺炎球菌有顯著的抑制作用，因此成為中醫(yī)治療SARS和流感等病毒病時應用的藥材。同時，金銀花又是香料、化工和保健食品的主要原料之一[7]。

金銀花主產于我國河南、山東、河北等地，且以河南產“密銀花”“封丘金銀花”與山東產“濟銀花”較為道地[8]， 河南的“密銀花”和山東的“濟銀花”最為著名[9]。此外，四川、廣西、江西、江蘇、陜西和甘肅等地均有野生[10]。同時相關研究表明，金銀花屬多年生半常綠纏繞及匍匐莖灌木，適應性強、抗逆性強，對土壤要求不嚴，根系繁密發(fā)達，萌蘗性強，莖蔓著地即能生根，觀賞和水土保持價值高[11]，栽培金銀花可有效改善土壤理化性質，防治水土流失，培肥土壤地力[12]，是一種極具開發(fā)潛力的生態(tài)、環(huán)保、經濟型植物，和秦巴山區(qū)改善生態(tài)環(huán)境、推動經濟發(fā)展的藥材品種。近年來，許多學者對金銀花化學成分、藥理、種質與良種選育、規(guī)范化種植等技術進行了大量研究，取得了豐碩成果，但沒有關于金銀花自然狀況下根際土壤理化性質、真菌多樣性與群落結構的變化對金銀花田間管理與野生撫育方案的影響這方面的報道[13]。由于對藥用植物種植保護的影響，特別是考慮到正在發(fā)生的氣候變化，研究適宜種植地的藥用植物(如金銀花)與相關的微生物之間的相互作用正變得越來越重要?；诖?，本文系統(tǒng)研究了金銀花6年生根際土壤化學性質和土壤真菌群落結構的變化規(guī)律，分析了二者的相互關系，為商洛乃至秦巴山區(qū)金銀花的科學田間管理與野生撫育方案的確定提供一定的理論指導。

1 材料和方法

1.1 試驗樣地概況

金銀花實驗樣地位于陜西省商洛市柞水縣下梁鎮(zhèn)西川農業(yè)示范產業(yè)園，屬于秦嶺南麓，氣候為暖溫帶間涼亞熱帶過渡性氣候，該區(qū)域年均日照1 860.2 h，年均氣溫12.4 ℃，最冷月平均氣溫0.2 ℃，最熱月平均氣溫23.6 ℃。極端最高氣溫37.1 ℃，最低-13.9 ℃，無霜期209 d，年降水量742 mm，四季分明，溫暖濕潤，夏無酷暑，冬無嚴寒，宜長、短日照和需不同溫濕度的植物發(fā)育生長。

1.2 土壤樣品的采集

2019年7月在金銀花試驗園中選取自然生長狀況下6 a生金銀花根際土壤(Y6)樣本作為研究對象，選擇距離金銀花居群根際較遠的空地樣品(下文稱非根際土壤) 作為對照組(CK)。在金銀花居群采樣時, 通過五點采集法，以金銀花樹主莖為中心在半徑約 20～30 cm 的范圍內取土, 取土深度為0～25 cm, 采集對照組樣品時，選擇5處距離金銀花居群根際較遠的空地進行采樣，采樣深度為0～25 cm。土樣采集完畢后混勻裝入無菌的牛皮紙袋中, 放入冰盒內帶回實驗室[14]。去除土壤中的殘留根系、石塊、其他雜質并過2 mm孔徑篩子后, 將土壤一部分自然風干用于測定土壤化學性質，另一部分低溫保存于-80 ℃超低溫冰箱內，用于后續(xù)土壤微生物真菌多樣性的確定。

1.3 土壤化學性質測定

土壤中大量與微量元素含量的測定采用PW2403型X-Ray熒光光譜儀(Brukers8，德國)，土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮以及磷酸鹽的含量測定采用Smart Chem300全自動間斷化學分析儀(Westco SmartChem300) ，具體操作參照儀器生產商提供的參考方法。

1.4 高通量測序

利用土壤專用DNA提取試劑盒(MOBIO Power Soil DNA Isolation Kit，USA) 提取樣本基因組DNA后，測定總DNA濃度，并利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA提取質量。選擇質量合格的DNA樣品進行真菌ITS區(qū)Paired-end測序，由北京百邁客科技有限公司完成文庫制備、均一化、檢測、上機測序及數(shù)據(jù)質量控制等工作。數(shù)據(jù)分析參考張玥等人[15]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

主要使用SPSS 19.0和Microsoft Excel 2010對結果進行處理與生物信息學分析。

2 結果與分析

2.1 根際與非根際土壤化學性質

根際土壤化學性質測定結果表明(表1)，金銀花根際土壤的NH3-N、A-P、S含量達到非根際土壤的2倍左右，差異達到顯著 (P<0.05)。非根際土壤中微量元素Fe3+、Mn2+、Zn2+的含量要比根際土壤中的含量高，無顯著差異(P>0.05)。

2.2 樣品測序深度評估

通過Illumina HiSeq測序平臺對6個真菌樣品測序，序列優(yōu)化后最終得到優(yōu)質序列90 283條，有效序列的長度主要分布在191～310 bp區(qū)段內，其中221～250 bp區(qū)段內分布最多?；?7%相似性水平，將隨機抽取測序序列所得序列數(shù)與它們所能代表OTU數(shù)目構建稀釋曲線，聚類OTU并制作各樣品的稀釋曲線(圖1) ，以此可評估測序數(shù)據(jù)量是否足夠[16]。兩份樣品的稀釋性曲線均顯示隨著隨機抽取的樣本真菌測序量不斷增大，各樣品OTUs數(shù)目的增加趨于平坦，說明測序深度基本可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。

圖1 2組樣本中真菌測序的稀釋曲線

2.3 根際與非根際土壤真菌數(shù)量分析

由不同樣品OTU數(shù)量關系 Venn 圖(圖2) 可見，2組樣品中共獲得795個真菌OTUs。其中，根際土壤674個，非根際土壤576個。非根際土壤和根際土壤中所獨有的OTU數(shù)量分別為121和219，2組樣品共有的 OTU有455個。

圖2 根際與非根際土壤真菌OTU的Venn圖

2.4 根際與非根際土壤真菌Alpha多樣性分析

對指示群落結構變化的4個Alpha多樣性指數(shù)ACE、Chao1、Simpson和Shannon指數(shù)進行組間差異性分析。結果(表2)顯示，Y6組中ACE和Chao1指數(shù)顯著高于對照組(CK)，其余各組間多樣性指數(shù)均無顯著性差異，其中CK、Y6的土壤真菌ACE指數(shù)分別為424.25、522.97。 從Chao1指數(shù)分析來看，Y6組(534.54)的土壤真菌物種豐富度較CK組高；從Shannon指數(shù)分析來看，Y6組(4.43)的土壤真菌物種多樣性高于CK(4.25)。

表2 根際與非根際土壤真菌群落Alpha指數(shù)

2.5 根際與非根際土壤真菌群落組成的比較分析

根際土壤樣本中真菌群落的主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的樣品差異性貢獻率分別達到75.89%和13.49%(圖3)。Beta多樣性分析表明：非根際土壤(CK)與樹齡6 a的金銀花樹根際土壤(Y6)的真菌群落有差異。

圖3 根際與非根際土壤真菌群落的主成分分析(PCA)

2.6 根際與非根際土壤真菌群落組成

物種組成分析反映樣品在不同分類學水平上的群落結構，圖4(a)和圖4(b)分別展示科水平和屬水平的群落結構和分類比較結果，由此可知，CK與Y6土壤根際真菌在科水平和屬水平的相對豐度分布差異較大，與主成分分析(PCA)結果(圖3)一致。 在科的水平上，鑒定出曲霉科Aspergillaceae(13.11%)、毛殼菌科Chaetomiaceae(10.96%)、肉座菌科Hypocreaceae(5.17%)、Piskurozymaceae(3.87%)、赤殼科Nectriaceae(9.81%)、Ophiocordycipitaceae(1.02%)、Plectosphaerellaceae(2.96%)在CK中的相對豐度較大；被孢霉科Mortierellaceae(11.15%)、枝孢霉科Cladosporiaceae(3.04%)、麥角菌科Clavicipitaceae(3.43%)、Peniophoraceae(8.23%)、Trichomeriaceae(1.25%)、Hyaloscyphaceae(0.88%)在Y6中的相對豐度較大。在屬水平，鑒定出20個屬，曲霉屬Aspergillus(12.16%)、尖孢鐮刀菌屬Fusarium(2.42%)、Fusicolla(0.89%)、赤霉菌屬Gibberella(0.86%)、腐質霉屬Humicola(4.38%)、Plectosphaerella(2.02%)、Purpureocillium(0.89%)、Solicoccozyma(3.78%)、Tausonia(3.04%)、木霉屬Trichoderma(5.17%)在CK中的相對豐度較大；青霉菌屬Penicillium(1.32%)、被孢霉屬Mortierella(11.15%)、Subulicystidium(8.23%)、Knufia(1.20%)、枝孢霉屬Cladosporium(11.15%)、Metarhizium(3.20%)、Mrakia(3.41%)、Pleurotheciella(0.97%)在Y6中的相對豐度較大。

圖4 根際與非根際土壤真菌群落科水平(a)與屬水平(b)豐度聚類熱圖

2.7 組間差異顯著性分析

LEfSe能夠在不同組間尋找具有統(tǒng)計學差異的真菌種類。進化分支圖由內至外輻射的圓圈代表了由門至種的分類級別；在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比；著色原則為將無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，其他差異物種按該物種所在豐度最高的分組進行著色[15]。2組樣品中LEf Se分析進化圖(圖5)顯示，在非根際土壤(CK)、根際土壤(Y6)中共具有15種顯著差異的菌種，其中Y611種，CK4種。 從物種分類看，目水平下有2種，科水平下有4種，屬水平下有5種，種水平下有4種。

圖5 根際與非根際土壤真菌群落Lefse分析進化分支圖

2.8 土壤化學因子對土壤真菌群落多樣性的影響

選取的6個環(huán)境因子對金銀花根際土壤真菌群落組成都有一定程度的影響(表3)。根際土壤NH3-N、A-P與土壤真菌物種豐富度呈極顯著正相關(P<0.01)，S與土壤真菌物種豐富度呈顯著正相關(P<0.05) ，F(xiàn)e3+、Zn2+與土壤真菌物種豐富度呈顯著負相關(P<0.05)。

表3 根際土壤真菌多樣性影響因子匯總表

2.9 真菌群落結構與土壤化學性質相關性分析

RDA分析反映菌群與化學環(huán)境因子之間的關系，真菌RDA的累計貢獻率RDA1 39.24%，RDA2 21.18%(圖6)。影響按大小排序：A-P>NH3-N>S>Zn2+>Fe3+。Solicoccozyma、Tausonia、木霉屬Trichoderma、尖孢鐮刀菌屬Fusarium、曲霉屬Aspergillus和腐質霉屬Humicola與A-P、NH3-N、S呈負相關，與Fe3+、Zn2+呈正相關；被孢霉屬Mortierella、Subulicystidium和Metarhizium則相反，與A-P、NH3-N、S呈正相關，與Fe3+、Zn2+呈負相關。

3 結論與討論

3.1 金銀花根際與非根際土壤的化學性質

土壤作為金銀花樹養(yǎng)分吸收及儲藏的載體，土壤肥力指標的變化對于金銀花樹的生長、金銀花的產量及其品質具有一定的影響。本研究結果表明，金銀花根際土壤的NH3-N、A-P含量達到非根際土壤的2倍左右，差異達到顯著 (P<0.05)。有文獻證明[17]， 根際的微生物種群不斷地接觸到來自根的低分子量和高分子量有機質，可能會影響特定的物理化學和生物條件、微生物活動以及根際土壤微生物群落結構。說明隨著生長年限的增加，凋落物的質量和數(shù)量會通過改變植物群落組成而改變，從而來影響凋落物的分解；通過改變土壤環(huán)境及其生物活性，進而啟動舊的穩(wěn)定有機質分解，從而促使N、P的含量增加。王海斌等[18]研究發(fā)現(xiàn)，茶樹根系分泌有機酸改變根際土壤理化性質，使根際土壤磷酸鹽有效性提高，利于茶樹對磷的吸收和品質改善，與本文研究結果一致。

圖6 土壤化學性質與真菌群落(屬水平)的冗余分析

土壤中的微量元素是土壤的重要組成成分，是表征土壤質量的重要因子，在促進作物生長代謝及提高產量與品質方面具有十分重要的作用[19]，它的組成及其變化特征直接反映了土壤發(fā)育、成土及其演化過程。此外，微量元素參與許多酶系統(tǒng)的活動，在氮、磷、碳的代謝過程中以及在生物氧化過程中均有微量元素參與。呼吸作用、光合作用、碳水化合物的運轉均離不開微量元素。在本研究中，根際土壤中Fe3+、Mn2+、Zn2+等微量元素含量較非根際土壤低，也側面說明了金銀花植株在生長過程中需要從土壤中大量吸收這些微量元素進行呼吸作用等以滿足其生長所需。

3.2 金銀花根際與非根際土壤真菌的多樣性

成熟的土壤肥力是依靠微生物的不斷活動來保持的。通過熱圖分析，樣品間的優(yōu)勢真菌科與屬差異顯著。真菌群落的明顯分化和聚類表明根際土壤和非根際土壤具有不同的真菌群落。

被孢霉科Mortierellaceae、枝孢霉科Cladosporiaceae、麥角菌科Clavicipitaceae、Peniophoraceae、Trichomeriaceae、Hyaloscyphaceae在根際土壤(Y6)為優(yōu)勢科，而曲霉科Aspergillaceae、毛殼菌科Chaetomiaceae、肉座菌科Hypocreaceae、Piskurozymaceae、赤殼科Nectriaceae、Ophiocordycipitaceae、Plectosphaerellaceae在CK中為優(yōu)勢科。赤殼科Nectriaceae隸屬肉座菌目，已有研究發(fā)現(xiàn)歸屬于子囊菌門的肉座菌目具有降解腐爛有機質，降解纖維素的作用[15]，毛殼菌科Chaetomiaceae隸屬于炭角菌目，營腐生，也是有較強分解纖維素能力的類群[20]。青霉菌屬Penicillium、被孢霉屬Mortierella、Subulicystidium、Knufia、枝孢霉屬Cladosporium、Metarhizium、Mrakia、Pleurotheciella在根際土壤(Y6)中為優(yōu)勢屬，曲霉屬Aspergillus、尖孢鐮刀菌屬Fusarium、Fusicolla、赤霉菌屬Gibberella、腐質霉屬Humicola、Plectosphaerella、Purpureocillium、Solicoccozyma、Tausonia、木霉屬Trichoderma在非根際土壤(CK)中為優(yōu)勢屬。其中，尖孢鐮刀菌屬Fusarium是引起枯萎病的主要病原菌屬[21-22]。分子孢子菌屬Cladosporium真菌是一種室內和室外都常見的霉菌，為腐生真菌，廣泛存在于自然界的土壤、某些動物的糞便、蔬菜、腐木、鳥巢、腐爛水果中[23]，會導致果實腐爛[22]。腐質霉屬Humicola真菌是土壤中常見的腐生菌，廣泛分布于世界各地的各種土壤，尤其是有機質豐富的土壤，部分種類也分布于植物殘體、木材或人體等[24]。被孢霉屬Mortierella是土壤中有益微生物，具有溶解土壤中磷的功能[25]，并且能夠通過提供氮營養(yǎng)和提高植物的抗病性促進植物的生長，可能與植物的糖代謝有關[26]。

吳佳徽[27]研究表明，植物根系的分泌物為根際微生物提供了豐富的營養(yǎng)和能量，因此植物根際微生物數(shù)量和活性常高于非根際土壤，使得植物根系表現(xiàn)出特定的“根際效應”。由于根際效應的存在，根際微生物的數(shù)量大于非根際微生物[21]。由于植物的根排斥某些細菌和真菌，并促進其他代表其物種特異性伙伴的建立，包括有益細菌和菌根真菌[28-30]。所以青霉菌屬Penicillium、被孢霉屬Mortierella、枝孢霉屬Cladosporium等對植物有益的真菌屬在根際土壤中的數(shù)量和活性要高于在非根際土壤中。

3.3 影響金銀花根際與非根際土壤真菌多樣性的因素

張澤[31]研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物在有機質分解、養(yǎng)分運轉、土壤結構維持和土壤污染物凈化等方面發(fā)揮重要作用的同時，微生物自身還含有一定數(shù)量的N、P、S等，對土壤肥力的提高有重要作用。鄧大豪等[32]研究表明，在香蕉種植地土壤微生物多樣性及其對土壤理化性質的響應中，以真菌途徑為主的土壤有利于存貯有機質和固態(tài)氮，氮和能量轉化較緩慢。這些研究結果均與本研究中NH3-N、A-P與土壤真菌物種豐富度呈極顯著正相關關系，S與土壤真菌物種豐富度呈顯著正相關(P<0.05) 關系結論一致。Fe3+、Zn2+與土壤真菌物種豐富度呈顯著負相關(P<0.05) 關系，也印證了根際土壤中的真菌物種豐富度較非根際土壤大。

RDA分析主成分 RDA1、RDA2，貢獻率分別為39.24%和21.18%，表明并非單一土壤理化性質能夠顯著影響土壤微生物的群落結構和物種組成，而是綜合因素共同作用的結果。同時本研究表明，金銀花根際土壤中真菌的豐富度和多樣性與土壤的化學特性有關。

王西銳等[21]研究發(fā)現(xiàn)，植物的根際微生物能夠合成微生物生長發(fā)育所需的生長素類物質，如酵母促生素、硫胺素、核黃素和維生素等，而使土壤微生物數(shù)量上升，所以金銀花樹根際土壤的真菌數(shù)量比非根際多，也可認為金銀花樹的根際微生物能夠合成微生物生長發(fā)育所需的生長素類物質，再由輸入土壤生態(tài)系統(tǒng)的金銀花植物枯落物與土壤中其他物質一起被土壤中的微生物降解，對土壤中的微生物活性產生刺激或抑制作用，金銀花樹根系分泌N、P、S等提高土壤肥力的同時對Solicoccozyma、Tausonia、木霉屬Trichoderma、尖孢鐮刀菌屬Fusarium、曲霉屬Aspergillus、腐質霉屬Humicola等有害真菌有抑制作用，而刺激被孢霉屬Mortierella、Subulicystidium、Metarhizium等土壤微生物生長，進而引起土壤微生物多樣性發(fā)生改變。

已有文獻表明[33]，真菌在改善土壤質量方面具有一定作用，本論文研究亦得出了這樣的結論，金銀花植物根系與真菌豐度和群落相互作用顯著相關，金銀花植物根系是改變真菌豐度和相互作用的最重要因素。