宋發(fā)軍，李妍清，楊瑞霜，孟艷艷

(中南民族大學 生命科學學院&生物技術國家民委重點實驗室&武陵山區(qū)特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，武漢 430074)

重樓皂苷是中藥重樓(ParidisRhizoma)最主要的活性成分，具有抗菌、解蛇毒等多重功效.然而，重樓的野生植物資源瀕臨枯竭，且重樓屬植物的種子休眠期長、人工繁育周期長[1-2]，從而導致重樓皂苷的供需矛盾日益突出.因此，解析重樓皂苷生物合成途徑中的關鍵基因，對實現(xiàn)人工合成重樓皂苷和保護野生重樓種質資源具有重要意義.

重樓皂苷主要包括薯蕷皂苷和偏諾皂苷兩大類，其生物合成途徑下游的關鍵酶類尚未被完全確認.研究表明，重樓皂苷合成的最后步驟中，薯蕷皂苷元被糖苷化生成各種薯蕷皂苷，或薯蕷皂苷元經過羥化生成偏諾皂苷元再苷化生成偏諾皂苷[3]，而大多數(shù)重樓皂苷的糖苷化主要是由尿苷二磷酸糖基轉移酶(UDP glucuronosyltransferase，UGT)負責催化的[3].因此，研究重樓中的UGTs有助于揭示重樓皂苷的合成機制.目前重樓中被鑒定和表征的UGTs數(shù)量還很少.基因組信息的欠缺和有限的轉錄組數(shù)據(jù)，阻礙了重樓皂苷生物合成途徑中UGTs的研究.本課題組前期以中藥重樓的正品藥源植物七葉一枝花為研究對象，進行了全長轉錄組的測序工作.本研究在已有數(shù)據(jù)的基礎上，利用隱馬爾可夫模型篩選UGTs；同時提取七葉一枝花不同組織的RNA，通過qRT-PCR技術明確UGTs的表達特征，獲得可能參與重樓皂苷生物合成的目標UGTs.

1 材料與方法

1.1 材料與處理

七葉一枝花根狀莖、根、葉、花、莖及種子均采集于湖北省恩施土家族苗族自治州鶴峰縣.根狀莖等組織材料均采集于2019年5月，各組織材料迅速放于液氮中冷凍，隨后保存于-80 ℃冰箱中超低溫凍存?zhèn)溆?七葉一枝花種子采集于2019年10月，去種皮，洗凈，晾曬干后保存于4 ℃冰箱.

1.2 七葉一枝花 UGTs 成員鑒定與注釋

利用隱馬爾可夫模型從七葉一枝花轉錄組數(shù)據(jù)中篩選出UGT基因.使用CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線軟件分析各個基因所編碼蛋白的結構域.

1.3 七葉一枝花UGT蛋白理化性質分析

利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析七葉一枝花UGT蛋白的基本理化性質，如氨基酸數(shù)量、分子量及等電點等.

1.4 七葉一枝花 UGTs 進化關系及motif分析

使用MEGA5.0和Clustalx工具分析蛋白系統(tǒng)進化關系，并采用NJ法構建系統(tǒng)進化樹；蛋白motif基序分析利用MEME軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)完成.

1.5 七葉一枝花UGT蛋白結構分析

通過 SWISS-MODLE(http://swissmodel.expasy.org/)方法在線對蛋白質進行三維立體結構進行預測，隨后利用saves(http://servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/)對所得模型進行評估.

1.6 七葉一枝花各組織的RNA提取

葉、花、莖、種子用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA(北京天根生化)；根狀莖、根用CTAB法結合RNA純化試劑盒(北京天根生化)提取RNA.所得RNA經超微量分光光度計(Nanophotometer N50 Touch，美國Thermo公司)測量濃度、瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后于-80 ℃下保存?zhèn)溆?

1.7 七葉一枝花 UGTs 定量表達分析

UGT家族基因的引物合成由上海生工完成(表1).使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)試劑盒進行反轉錄獲得cDNA，實時熒光定PCR儀為QuantStudio5(Applied Biosystems，美國).選用GAPDH為內參基因.

表1 七葉一枝花UGTs實時熒光定量分析引物

qRT-PCR的總反應體系為20 μL：2 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL，SYBR 10 μL，RNase-Free ddH2O補齊至20 μL；反應程序為：95 ℃ 預變性1 min，95 ℃變性15 s，54.5 ℃退火35 s，72 ℃ 延伸30 s，40個循環(huán)，重復3次.擴增后分析擴增曲線及熔解曲線，采用2-ΔΔCT法計算待測基因的相對表達量.

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

Microsoft Excel 2016及GraphPad Prism 8進行統(tǒng)計分析和圖表繪制，結果以3次重復的平均值±標準差(SD)表示；MeV4.8.1繪制表達量聚類分析圖譜.

2 結果與分析

2.1 七葉一枝花 UGTs 的篩選及motif分析

利用七葉一枝花的轉錄組數(shù)據(jù)庫建立隱馬爾可夫模型，篩選出屬于糖基轉移酶基因家族的序列，HMMER軟件對其進行提取和分析，共獲得54個UGT類似基因.CDD分析蛋白序列保守結構域，發(fā)現(xiàn)所獲得的序列均含有UDPGT(UDP-glucoronosyl and UDP-glucosyltransferase)結構域，檢查缺失并去除冗余序列，鑒定得到屬于UGT家族的45個基因序列片段，分別將其命名為PpUGT01～ 45.

MEME對45個UGTs進行motif分析.除去部分較短序列外，有31條序列中含有糖基轉移酶特征盒子PSPG box(putative secondary plant glycosyltransferase box)(圖1)，與植物典型的PSPG box(44個氨基酸)完全一致的氨基酸有32個.其中第5位谷氨酰胺、第9位亮氨酸、第11位組氨酸、第17位苯丙氨酸、第22位甘氨酸、第28位谷氨酸、第40位脯氨酸高度保守.

圖1 45個UGT蛋白的氨基酸保守序列

2.2 七葉一枝花候選UGTs的理化性質分析

45個UGTs的cDNA全長在138～1437 bp之間(表2)，編碼的氨基酸長度在46～479之間，蛋白分子為4998.80～53406.59 D，理論等電點為4.36～11.12，其中有中性蛋白質1個(PpUGT40)、堿性蛋白質4個，分別為PpUGT13、PpUGT37、PpUGT41和PpUGT45，其他均屬于酸性蛋白質.

表2 45個UGTs的理化性質

2.3 糖基轉移酶基因家族的進化分析

對所得的45個UGTs和擬南芥UGT家族中的119個、北柴胡1個(BcUGT10)、人參3個(PgUGT71A27、PgUGT74AE2和PgUGT94Q2)、三七3個(Pn00082、Pn02086和Pn13895)、王不留行1個(GvUGT74M1)及蒺藜苜蓿3個(MtUGT71G1、MtUGT73K1和MtUGT85H2)、刺茄1個(SaGT4A)、馬鈴薯1個(StSGT)共177個UGTs采用NJ法構建了系統(tǒng)發(fā)育樹.依據(jù)序列聚類關系及氨基酸序列一致性≥40%的基因歸為同一家族的分類原則[4]，并參考擬南芥[5]、玉米[6]的UGT分組方式，將177個UGTs分為14個組.由圖2可知，七葉一枝花中的45個PpUGTs中有15個分布在D組(UGT73家族)中；8個UGTs分布在A組；6個UGTs分布在K組；4個UGTs分布在L組；4個分布在G組；I組、E組、UGT81家族中分別有2個UGTs；UGT80家族中有1個UGT分布.45個基因主要分布在A、D、G、L、K組中，共有38條序列，占所有序列的84%，而B、C、N、F、H組中未見PpUGT的分布.

圖2 七葉一枝花UGTs的進化樹分析

2.4 七葉一枝花 UGTs 在各組織中的表達分析

為了進一步了解UGT家族不同基因的表達特征及其潛在的功能，對45個基因在不同組織中的表達情況也進行了分析(圖3).

qRT-PCR分析結果表明，七葉一枝花中的45個UGTs的表達趨勢主要分為6類：根狀莖中表達量顯著上調的UGTs有7個，其中有3個UGTs(PpUGT27、PpUGT30和PpUGT40)在根中表達量也較高；葉中表達量顯著上調的UGTs共6個，其中PpUGT25在根中表達量也較高，而PpUGT36在花和莖中表達量也有上調；莖中表達量顯著上調的UGTs有10個，其中5個UGTs(PpUGT33等)在葉中表達量也較高；種子中表達量顯著上調的UGTs有5個；花中表達量顯著上調的UGTs有4個；根中表達量顯著上調的UGTs有13個，其中有5個UGTs(PpUGT06等)同時在莖中表達量較高，而PpUGT45花和莖中表達量均上調.

研究發(fā)現(xiàn)，包括UGTs在內的多個甾體皂苷合成相關基因在葉片和果實中的表達量較高，因此葉片可能是甾體皂苷類物質合成的主要器官[7].此外，D組和UGT80家族的基因被證明參與了皂苷的合成[8-9].因此，根據(jù)qRT-PCR結果，著重分析了在葉片中的表達量顯著升高的D組和UGT80亞家族中的UGTs成員.同時考慮到工作量以及試驗的準確性等問題，為了進一步鎖定候選UGTs序列，重點關注序列長度不低于800 bp的UGTs.初步篩選出了PpUGT01、PpUGT11、PpUGT18、PpUGT42和PpUGT45 5個候選基因(圖4).PpUGT01和PpUGT11在葉中表達量顯著上調，且PpUGT11在根、花、莖中表達量也較高；PpUGT18基因在根、花和種子中表達量均較為顯著，在葉和莖中表達量也較高；PpUGT42基因在莖中表達量顯著上調，在花、葉中表達量較根狀莖中也有所上調.此外，屬于UGT80家族的PpUGT45在根、花、莖中表達量較高，葉和種子中也有表達.

圖4 5個候選UGTs在不同組織中的表達量

2.5 七葉一枝花候選UGT的三維結構預測

采用SWISS-MODLE方法，對PpUGT01、PpUGT11、PpUGT18、PpUGT42和PpUGT45 5個候選基因的蛋白序列進行了三維空間結構的預測(圖5).結果發(fā)現(xiàn)，上述5個蛋白質均為單分子的寡肽結構，沒有配體，覆蓋率分別為91%、91%、91%、93 %和97%，利用Saves對所得模型進行評估，Verify 3D均有超過80%的殘基有大于0.2的3D/1D值，ERRAT評分均為A，whatcheck檢測顯示5個蛋白結構與正常結構差異較小，5個蛋白均有三項指標能通過評估，表明預測結果比較可靠.

圖5 5個候選UGT蛋白的預測三維結構圖

3 討論

植物皂苷在結構上通常由一個或多個親水性糖殘基和疏水性類固醇或三萜類成分組成，糖殘基是皂苷化合物親水性能的決定因素[10-11].UGT可催化糖基殘基裝配皂苷元.UGT家族中的大多數(shù)成員在C末端有一個由44個氨基酸殘基構成的PSPG box，該box是將次級代謝產物糖基化的植物UGT的標志性基序[12]，它被認為是糖基轉移酶識別、結合供體分子的位點[13].本研究篩選得到的45個UGTs中，31條UGTs均具有典型的植物UGT的PSPG box.這表明篩選出的序列符合UGT家族特征，可用于進一步的分析和研究.

文獻表明有底物催化活性的UGT主要分布在A、D、E、G、H、L六組中[4,6,14].本研究中共有34條UGTs序列分布在上述6個組中，表明這些基因可能參與七葉一枝花中次級代謝產物的修飾及合成.此外，甾體皂苷的骨架形成分為兩個階段，即UGT催化C-26的糖基化和β-葡糖苷酶去除葡萄糖分子以封閉F環(huán)[7].人們發(fā)現(xiàn)，UGT73家族(即D組)中的基因可將糖分子連接到C-26的位置[8]，在其他植物中關于UGT73家族成員的研究還有：蒺藜苜蓿UGT73K1參與三萜皂苷合成[15]、擬南芥UGT73C6參與類黃酮的糖基化[16].另外，UGT73家族的基因還參與了重樓皂苷主鏈的后期修飾[9].因此本研究中獲得的聚類在UGT73家族中的4個基因(PpUGT01、PpUGT11、PpUGT18和PpUGT42)，極有可能含有參與重樓皂苷合成的UGT成員.擬南芥中UGT80A2可催化膽甾醇與UDP-葡萄糖的結合[17]，UGT80B1也具有甾醇葡糖基轉移酶的活性[18]，并且擬南芥UGT80家族參與甾醇糖苷和?；薮继擒盏姆e累[18].更重要的是七葉一枝花中有UGT80家族成員已經被鑒定出，實驗結果表明可能參與了甾體皂苷的生物合成[9].因此，本研究篩選出UGT80家族中的PpUGT45基因，或與重樓皂苷合成有密切關聯(lián).

皂苷生物合成的初始步驟可能發(fā)生在葉中，而皂苷的存儲等后續(xù)步驟則發(fā)生在根部[19].本實驗篩選出PpUGT01、PpUGT11、PpUGT18、PpUGT42和PpUGT45 5個候選基因.這5個候選基因存在于葉、花、莖等組織中,表達量分析表明均有所上調，推測可能與重樓皂苷自合成部位葉向儲存部位根的輸送有關.此外，對5個候選基因的蛋白質序列建模結果表明，所得模型均較可靠，這些結果為進一步研究UGT蛋白的結構與功能關系提供了理論依據(jù)，同時為后期UGT候選蛋白的分析及催化底物篩選奠定了基礎.