周莉，趙乃玉，何元鵬，顏大林，董德嶠，梁馨琳

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430070)

昆侖雪菊(Coreopsistinctoria)，又名兩色金雞菊，盛產(chǎn)于我國(guó)新疆昆侖山脈海拔3000 m以上的高寒積雪地區(qū)[1].其作為中藥具有清熱解毒、治療胃腸不適、治療痢疾等功效[2]，并且含有黃酮類、酚類、苯丙素、甾醇類、聚乙炔類等多種活性成分，可以用于高效降低血糖血脂、抗菌消炎、抗氧化、降血壓、細(xì)胞修復(fù)和抗癌[3-5].

昆侖雪菊提取物的活性研究已經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)話題，例如黃酮類化合物馬里苷可以保護(hù)PC12細(xì)胞免受甲基乙二醛誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6]，保護(hù)人髓核細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的損傷和細(xì)胞外基質(zhì)降解，直接抑制腎臟SGLT2的表達(dá)來(lái)預(yù)防糖尿病腎病[7-8],除此以外，黃諾馬苷通過(guò)靶向絡(luò)氨酸激酶，有望成為糖尿病腎病的藥物靶點(diǎn)[9]；2014年有人[10]用55%的乙醇提取多酚并評(píng)價(jià)其抗氧化能力，后續(xù)通過(guò)活性研究發(fā)現(xiàn),多酚擁有預(yù)防心血管疾病[11]、腦衰老和急性肝損傷的保護(hù)作用[12-13].基于昆侖雪菊中多酚擁有如此重要功效，多酚的提取便成為亟待解決的問(wèn)題.本研究將采用超聲輔助響應(yīng)曲面法提取昆侖雪菊多酚，以期得到最佳參數(shù)組合.

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

昆侖雪菊，產(chǎn)自新疆和田阿克蘇地區(qū)阿克蘇市金石花園(尚士華果業(yè)).

無(wú)水乙醇(AR，GENERAL-REAGENT公司)沒(méi)食子酸(99%，MACKLIN)；無(wú)水碳酸鈉(分析純AR，上海凌峰)；福林酚(BR，MACKLIN).

分析天平(ME204,瑞士 METTLER TOLEDO);超聲波清洗機(jī)(SB-5200 DTD,寧波新芝);酶標(biāo)儀(SPARK 10M,美國(guó) TECAN);循環(huán)水式真空泵(鞏義予華儀器).

1.2 昆侖雪菊多酚提取法

將罐裝的干燥雪菊用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40～50目篩備用.稱取適量的雪菊粉末加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，放入超聲機(jī)中提取一段時(shí)間，抽濾得到提取液，定容至50 mL,測(cè)定多酚的含量，并按照(1)式計(jì)算多酚提取量：

(1)

式中：C是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來(lái)的提取液中多酚質(zhì)量濃度(μg/mL)；N為稀釋倍數(shù)；M為雪菊的質(zhì)量(g).多酚含量按照GB/T 8313—2018的步驟，采用福林酚比色法[14]進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果以每克昆侖雪菊的干物質(zhì)中所含的沒(méi)食子酸當(dāng)量(mg GAE/g DW)表示.所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用GraphPad Prism8.0.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.

1.3 提取影響因素分析

1.3.1單因素試驗(yàn)方法

通過(guò)控制單一變量測(cè)試影響雪菊多酚提取因素.(1)乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取量的影響：稱取雪菊粉末12份，每份1 g，分別加入體積分?jǐn)?shù)30%、40%、50%、60%的乙醇溶液40 mL，各3組；在35 ℃下超聲提取15 min，抽濾收集提取液定容到50 mL，測(cè)定吸光度并計(jì)算多酚的提取量.(2)料液比對(duì)多酚提取量的分析：以40%的乙醇溶液作為提取溶劑，料液比(質(zhì)量比體積,g∶mL)分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，其余條件同實(shí)驗(yàn)(1).(3)取時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響：以體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液作為提取液，提取時(shí)間分別為20、30、40、50 min.其余條件同實(shí)驗(yàn)(1).

1.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方法

影響昆侖雪菊多酚提取量的因素很多，已有文獻(xiàn)報(bào)道了超聲功率、溫度等因素的影響效果.本文重點(diǎn)關(guān)注乙醇濃度、提取時(shí)間和液固比對(duì)昆侖雪菊多酚提取量的影響,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)綜合考慮乙醇濃度、提取時(shí)間和液固比對(duì)昆侖雪菊多酚提取量的影響，響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示.

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取溶劑乙醇濃度

由圖1可知，多酚提取量隨著乙醇濃度的升高，表現(xiàn)出先增后降的變化.乙醇濃度在30%～50%范圍內(nèi)，雪菊多酚提取量最多.多酚易溶于酒精，屬于弱極性物質(zhì)，乙醇的濃度和溶液的極性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，增加前者的濃度會(huì)使得多酚更容易溶解于乙醇和水的復(fù)合體系中，但當(dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí)，雪菊細(xì)胞中溶于液泡的多酚會(huì)隨著蛋白質(zhì)的變性而無(wú)法提取出來(lái)，加之溶液與多酚極性差異過(guò)大從而使得多酚的提取量降低.所以選擇乙醇濃度40%做為最佳的提取劑濃度.

圖1 乙醇濃度對(duì)多酚提取量的影響

2.1.2 料液比

多酚提取量隨著料液比的增加而逐漸增大，后穩(wěn)定波動(dòng)趨于不變(圖2).當(dāng)溶劑達(dá)到60 mL時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大值.隨著溶劑的增加，雪菊粉末與溶劑充分接觸，有利于多酚由內(nèi)部向溶劑擴(kuò)散，當(dāng)達(dá)到60 mL之后，基本上多酚全部被提取出來(lái).再增加溶劑時(shí)，多酚提取量基本保持不變.從生產(chǎn)成本角度考慮，當(dāng)料液比為1 g：60 mL時(shí)所得到的提取量最好.

圖2 料液比對(duì)多酚提取量的影響

2.1.3 提取時(shí)間

由圖3可知，多酚提取量隨著提取時(shí)間的增加而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì).40 min時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大.當(dāng)時(shí)間過(guò)短時(shí)，多酚溶解的不夠充分，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，多酚內(nèi)外濃度差逐漸趨于平衡.當(dāng)提取量達(dá)到最大時(shí)，時(shí)間繼續(xù)增加,其他物質(zhì)也會(huì)溶出，競(jìng)爭(zhēng)限制了多酚的提取，同時(shí)由于多酚長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，發(fā)生氧化，從而使提取量降低.因此，選擇40 min為最佳提取時(shí)間.

圖3 時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)曲面模型建立及回歸方程顯著性結(jié)果分析

使用Design Expert軟件分析表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立多元回歸模型[5].擬合得到的多酚提取量(mg/g)與乙醇濃度(a)、提取時(shí)間(b)和溶劑體積與雪菊的質(zhì)量比(c)之間的二次多項(xiàng)回歸方程如下：

提取量=63.10+0.34a-0.72b+0.21c-1.83ab-0.060ac-2.03bc-3.14a2-2.64b2-2.95c2.

由表3可知，該模型的F=6.63，P=0.0104<0.05表明該模型的差異顯著.R2為0.9614，說(shuō)明該方程與對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值吻合程度能夠達(dá)到96.14%.此外，由F檢驗(yàn)可知影響多酚提取量的主次因素為提取時(shí)間>乙醇濃度>溶劑體積與雪菊質(zhì)量比.利用Design-Expert軟件計(jì)算得出乙醇濃度54.2%，提取時(shí)間為54.7 min，液固比為42∶1(mL∶g)時(shí)多酚提取量最高.在此條件下，雪菊多酚提取量的最大預(yù)測(cè)值為61.429 mg/g.

表3 響應(yīng)曲面二次模型的方差分析

2.2.3 響應(yīng)曲面交互作用及結(jié)果分析

乙醇的濃度、提取時(shí)間和液固比3個(gè)因素對(duì)昆侖雪菊多酚提取效果的響應(yīng)面圖和等高線圖見(jiàn)圖4.

由圖4可知，響應(yīng)面圖為先升后降的變化，乙醇濃度和提取時(shí)間、提取時(shí)間和液固比的等高線較為密布，可知這些因素之中的交互影響較明顯，對(duì)雪菊多酚的提取有一定的重要作用.

圖4 3因素對(duì)多酚濃度的交互影響

2.2.4 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將雪菊多酚的最佳提取條件調(diào)整為濃度54%的乙醇，料液比1 g：42 mL，時(shí)間55 min，這樣的情況下采取超聲波法進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)3次證明，所得的雪菊多酚提取量平均值為63.1 mg GAE/g DW.與預(yù)測(cè)值61.429 mg GAE/g DW差距不大，表明該結(jié)果是符合客觀實(shí)際的.所以，采取響應(yīng)面法優(yōu)化昆侖雪菊多酚超聲提取工藝合理可行.

3 結(jié)語(yǔ)

采用超聲波法提取昆侖雪菊多酚，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇實(shí)驗(yàn)提取劑乙醇濃度、提取時(shí)間和液固比為主要的影響條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，最后得到最好的工藝條件為乙醇濃度54%，料液比1 g：42 mL，時(shí)間55 min時(shí).昆侖雪菊多酚的提取量是63.1 mg GAE/g DW，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15]，昆侖雪菊中總酚含量是83 mg GAE/g DW.因此有效成分的轉(zhuǎn)移率是76%.該提取工藝該提取工藝具有較好的應(yīng)用價(jià)值，此外，該方法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、耗時(shí)少的特點(diǎn)，為昆侖雪菊有效成分的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).