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        癡復康方改善PSCI 大鼠的空間學習和記憶能力及其作用機制

        2021-04-16 05:07:02唐梁梁偉海陳志寧林國偉劉曉俊歐陽櫻君
        臨床醫(yī)學工程 2021年3期
        關(guān)鍵詞:劑量模型

        唐梁, 梁偉海, 陳志寧, 林國偉, 劉曉俊*, 歐陽櫻君

        (廣州市第一人民醫(yī)院 1 中醫(yī)科, 2 神經(jīng)內(nèi)科, 廣東 廣州510180)

        卒中后認知障礙 (PSCI) 是腦卒中的重要并發(fā)癥, 發(fā)病率極高 (80.97%)[1-2], 對患者的自理能力及生存質(zhì)量產(chǎn)生嚴重的影響。 著名中醫(yī)腦病專家劉茂才教授研制出治療PSCI 的癡復康方, 其臨床療效顯著, 但作用機制尚未明確。 NR2B/CaMKⅡ信號通路廣泛存在于腦神經(jīng)元中, 促進神經(jīng)突觸的重塑、 學習、 記憶功能, HMGB-1、 TGF-β1/Smad 信號通路在PSCI 發(fā)病過程中誘導神經(jīng)元的損傷和凋亡。 基于此, 本實驗通過對48 只大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎制作PSCI 模型, 觀察癡復康方對大鼠的空間學習、 記憶能力的改善情況, 檢測NR2B/CaMKⅡ信號通路及HMGB-1、 TGF-β1/Smad 信號通路以闡明其可能的作用機制, 現(xiàn)報道如下。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物

        SD 大鼠48 只, 雄性, 體重180 ~220 g, 由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供 [許可證號: SCXK (粵) 2018-0002]。

        1.2 造模

        SD 大鼠分離出左右頸總動脈, 用止血鉗夾住近心端頸總動脈, 用彎頭鑷排空遠心端血管中的血液, 對雙側(cè)頸總動脈行兩點結(jié)扎。

        1.3 分組及給藥方法

        將48 只SD 大鼠隨機分為正常組、 模型組、 尼莫地平組以及癡復康方低、 中、 高劑量組, 每組8 只。 正常組實施假手術(shù), 其余均實施雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎術(shù)。 低、 中、 高劑量組分別予以癡復康0.22 g·kg-1·d-1、 0.44 g·kg-1·d-1、 0.88 g·kg-1·d-1灌胃, 尼莫地平組予以尼莫地平1 mg·kg-1·d-1, 模型組、 正常組予以生理鹽水10 mL·kg-1·d-1, 均為1 次/d, 連續(xù)30 d。

        1.4 Morris 水迷宮實驗測試大鼠的空間學習和記憶能力

        1.4.1 獲得性訓練

        將水迷宮裝置水池分為4 個象限, 平臺置于其中一個象限區(qū)的中央。 將大鼠頭朝池壁放入水中, 記錄動物找到水下平臺的時間 (s), 連續(xù)訓練5 d。

        1.4.2 定向航行實驗

        第30 d 藥后1 h, 將大鼠面向池壁放入水中, 入水順序為Ⅲ象限→Ⅰ象限→Ⅳ象限→Ⅱ象限, 記錄90 s 內(nèi)大鼠登上平臺并停留3 s 所用時間, 即逃避潛伏期 (s), 超過90 s 記為90 s。

        1.4.3 空間探索實驗

        完成定向航行測試后, 立即撤去平臺, 將大鼠從原平臺象限對側(cè)第Ⅰ象限面向池壁放入水中, 記錄90 s 內(nèi)大鼠穿越原平臺次數(shù) (次) 和原平臺象限停留時間 (s)。

        1.5 病理切片觀察

        各組大鼠取腦組織, 經(jīng)過固定、 脫水、 包埋、 切片、 染色, 在顯微鏡下觀察并拍照。

        1.6 qPCR 法檢測大鼠腦組織中NR2B、 CaMKⅡ、 HMGB-1、TGF-β1、 Smad7 mRNA 的表達量

        根據(jù)Trizol 總RNA 提取試劑說明書提取總RNA, 測定濃度和純度, 取500 ng 總RNA 用于cDNA 合成, 根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 用于實時熒光定量PCR 反應, 檢測mRNA 的表達情況。

        1.7 統(tǒng)計學分析

        采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。 計量資料符合正態(tài)分布的, 以± s 表示, 采用單因素方差分析, 多重比較采用LSD 法,P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 癡復康方對大鼠逃避潛伏期、 穿越原平臺次數(shù)、 原平臺象限停留時間的影響

        與正常組相比, 模型組的逃避潛伏期延長, 穿越原平臺次數(shù)減少, 原平臺象限停留時間縮短, 差異有統(tǒng)計學意義 (P <0.01)。 與模型組相比, 低、 中、 高劑量組逃避潛伏時間均縮短, 原平臺象限停留時間均延長, 差異有統(tǒng)計學意義 (P <0.01)。 與模型組相比, 中、 高劑量組穿越原平臺次數(shù)均增加,差異有統(tǒng)計學意義 (P <0.01)。 見表1。

        表1 癡復康方對大鼠逃避潛伏期、 穿越原平臺次數(shù)和原平臺象限停留時間的影響 ( ± s)

        表1 癡復康方對大鼠逃避潛伏期、 穿越原平臺次數(shù)和原平臺象限停留時間的影響 ( ± s)

        注: 與正常組比較, aP <0.01; 與模型組比較, bP <0.01。

        組別 n 逃避潛伏期 (s) 穿越原平臺次數(shù)(次)原平臺象限停留時間 (s)高劑量組 8 43.89±7.56b 7.502±1.61b 25.79±9.17b中劑量組 8 52.49±10.13b 6.501±1.60b 24.05±7.67b低劑量組 8 62.27±9.32b 4.875±2.03 23.44±4.02b尼莫地平組 8 46.22±10.57 7.125±1.25 25.16±4.87模型組 8 68.63±14.43a 3.625±1.06a 10.15±3.90a正常組 8 51.67±9.80 8.250±1.49 26.88±3.43

        2.2 病理切片觀察

        模型組大鼠海馬神經(jīng)元明顯減少, 細胞排列松散, 不規(guī)則, 部分可見核仁消失、 錐體細胞減少; 癡復康方低、 中、 高劑量組隨著劑量增加, 大鼠海馬組織神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)改善明顯, 神經(jīng)元增加, 壞死細胞明顯減少, 細胞核固縮減少, 正常神經(jīng)元增加, 細胞輪廓清晰, 排列整齊, 其中以高劑量組改善最明顯。 見圖1。

        圖1 病理改變HE 染色 (×100)

        2.3 癡復康方對NR2B、 CaMKⅡ的影響

        與正常組相比, 模型組的NR2B、 CaMKⅡ表達減少, 差異有統(tǒng)計學意義 (P <0.01); 與模型組相比, 低、 中、 高劑量組的NR2B、 CaMKⅡ表達均增加, 差異有統(tǒng)計學意義 (P <0.01)。見表2。

        表2 癡復康方對NR2B、 CaMKⅡ的影響 ( ± s)

        表2 癡復康方對NR2B、 CaMKⅡ的影響 ( ± s)

        注: 與正常組比較, aP <0.01; 與模型組比較, bP <0.01; 與尼莫地平組比較, cP <0.01。

        組別 n NR2B CaMKⅡ高劑量組 8 0.88±0.05b 0.95±0.16b中劑量組 8 0.42±0.03bc 0.72±0.05b低劑量組 8 0.44±0.05bc 0.60±0.07bc尼莫地平組 8 0.97±0.11 0.90±0.13模型組 8 0.16±0.01a 0.13±0.01a正常組 8 1.00±0.09 1.00±0.06

        2.4 癡復康方對HMGB-1、 TGF-β1、 Smad7 的影響

        與正常組相比, 模型組的HMGB-1、 TGF-β1、 Smad7 表達均增加, 差異有統(tǒng)計學意義 (P <0.01); 與模型組相比, 中、高劑量組的HMGB-1 表達均減少, 差異有統(tǒng)計學意義 (P <0.01); 與模型組相比, 低、 中、 高劑量組的TGF-β1、 Smad7表達均減少, 差異有統(tǒng)計學意義 (P <0.01)。 見表3。

        表3 癡復康方對HMGB-1、 TGF-β1、 Smad7 的影響 ( ± s)

        表3 癡復康方對HMGB-1、 TGF-β1、 Smad7 的影響 ( ± s)

        注: 與正常組比較, aP <0.01; 與模型組比較, bP <0.01; 與尼莫地平組比較, cP <0.01。

        組別 n HMGB-1 TGF-β1 Smad7高劑量組 8 1.01±0.26b 0.92±0.05b 0.92±0.05b中劑量組 8 1.17±0.44b 1.83±0.10bc 1.83±0.10bc低劑量組 8 2.17±0.26c 2.27±0.16bc 2.27±0.16bc尼莫地平組 8 1.14±0.13 1.14±0.13 1.14±0.13模型組 8 2.21±0.23a 2.58±0.18a 2.58±0.18a正常組 8 1.00±0.10 1.00±0.09 1.00±0.09

        4 討論

        卒中后認知障礙 (PSCI) 的發(fā)病機制目前尚未完全明確,有相關(guān)研究[3]認為其可能與腦關(guān)鍵部位血管損害、 腦神經(jīng)退行性病變、 腦部炎性反應及遺傳有關(guān)。 N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA) 受體是一種分布在大腦海馬和皮層的離子通道型谷氨酸受體, 通過調(diào)控突觸可塑性和神經(jīng)元突觸長時程增強效應,在學習、 記憶方面起重要作用。 NR2B 作為NMDA 受體的重要功能亞基, 對于前額葉皮層神經(jīng)元突觸長時程增強效應的形成以及依賴前額葉皮層相關(guān)記憶的形成發(fā)揮重要作用[4]。 CaMKⅡ是大腦組織內(nèi)的非脯氨酸依賴蛋白激酶, 是學習、 記憶的分子基礎(chǔ), 參與神經(jīng)元突觸長時程增強效應。 NR2B 被激活后,促進Ca2+內(nèi)流激活CaMKⅡ, 刺激CaMKⅡ下游信號通路, 引起突觸后膜致密區(qū)磷酸化, 促進神經(jīng)元突觸長時程增強效應, 促進NR2B 表達, 從而增強學習記憶能力[5]。 但NR2B 過度表達會引起神經(jīng)元內(nèi)Ca2+超載而損害神經(jīng)元, 導致疾病發(fā)生[6]。NR2B/CaMKⅡ信號通路存在雙向作用, 既能改善認知功能,也可損害認知功能, 所以調(diào)節(jié)NR2B/CaMKⅡ信號通路是治療認知功能障礙的重要靶點。

        炎性因子在認知功能障礙發(fā)病中也起到重要的作用。HMGB-1 是組織受到缺血缺氧等刺激后大量釋放至細胞外的促炎性因子, 會加劇機體炎癥[7-8]。 相關(guān)研究[9]表明, HMGB-1在血管性癡呆患者血清中高表達, 且與其嚴重程度呈正相關(guān),與患者預后有明顯相關(guān)性。 TGF-β1/Smad 信號通路參與血管性癡呆的發(fā)病機制[10]: TGF-β1 在海馬等組織中表達, 與細胞膜受體結(jié)合, 使Smad 磷酸化, 調(diào)節(jié)靶向基因的表達, 其中Smad7 誘導細胞凋亡。

        本實驗結(jié)果表明, 癡復康方能夠改善PSCI 大鼠的空間學習、 記憶能力, 其機制可能與減少海馬神經(jīng)元壞死, 上調(diào)海馬組織NR2B、 CaMKⅡmRNA 表達, 下調(diào)HMGB-1、 TGF-β1、Smad7 mRNA 表達有關(guān), 其治療PSCI 的詳細機制還有待進一步的研究。

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