孟 海，趙成禮，潘偉偉,盧 芩

1.江蘇省鹽城市濱海縣人民醫(yī)院消化科，江蘇鹽城224500；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院消化科，江蘇南京 210009

WEE1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因家族的成員。在哺乳動(dòng)物中，WEE1編碼一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為94×103的蛋白，含647個(gè)氨基酸殘基，并與髓鞘轉(zhuǎn)錄因子組成一個(gè)小的基因家族[1-2]。有研究表明，WEE1在各種類型的人類惡性腫瘤中的表達(dá)增加，包括黑色素瘤、卵巢癌、肝細(xì)胞癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和乳腺癌，抑制WEE1的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[3-4]。此外，WEE1蛋白的選擇性抑制劑AZD1775通過促進(jìn)DNA修復(fù)而增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病對(duì)阿糖胞苷的敏感性[5]。因此，本研究選取74例胃癌患者、32例癌前病變患者、34例胃部良性疾病患者為研究對(duì)象，探討WEE1在胃部不同病變組織中的差異性表達(dá)及臨床意義，以期為胃癌的機(jī)制研究提供更多依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2011年1月至2013年9月濱?？h人民醫(yī)院收治的胃癌患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次確診胃癌。(2)術(shù)前未行放化療等抗腫瘤治療。(3)無胃部手術(shù)史及其他病史。(4)臨床資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)圍術(shù)期死亡病例。(2)合并有其他器官或系統(tǒng)的惡性腫瘤或有惡性腫瘤史。(3)因腫瘤相關(guān)腸梗阻等行急診手術(shù)。最終，74例患者被納入研究。其中男44例，女30例；年齡32～83歲，中位年齡54歲。選取同期因胃部癌前病變或胃部良性疾病而行切除手術(shù)的患者66例，其中腸型化生患者20例、異型增生患者8例、慢性萎縮性胃炎患者4例、胃部良性疾病患者34例，收集其標(biāo)本及預(yù)后數(shù)據(jù)(無瘤生存期和5年生存率)。

1.2方法 采用免疫組化法檢測(cè)胃部病變組織及正常組織中WEE1的表達(dá)。將2 μm厚度的組織切片在60 ℃下切烤1 h，二甲苯中脫蠟，乙醇洗滌(100%乙醇3 min，2次；95%乙醇3 min，2次；蒸餾水3 min)；隨后，切片在枸櫞酸緩沖液(0.01 mmol/L，pH值為6.0，購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)中進(jìn)行微波熱誘導(dǎo)抗原3 min，并冷卻至室溫，再逐漸加蒸餾水沖洗至少20 min；蒸餾水沖洗后，采用3%過氧化氫在室溫下阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；切片用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5次(每次2 min)；在4 ℃下與多克隆兔抗人WEE1抗體過夜孵育(稀釋度1∶75)；再次用PBS沖洗5次(每次2 min)后，切片用抗兔過氧化物免疫球蛋白G(稀釋度1∶300)在37 ℃下孵育30 min；蘇木精染色。通過計(jì)數(shù)區(qū)域的200個(gè)細(xì)胞檢測(cè)WEE1染色，這些細(xì)胞集中在腫瘤細(xì)胞上。根據(jù)以往研究評(píng)分[6]：0為無陽性細(xì)胞；1+為<10%陽性細(xì)胞；2+為10%～50%陽性細(xì)胞；3+為>50%陽性細(xì)胞。如果評(píng)分為0，則WEE1蛋白的表達(dá)被定義為WEE1陰性；如果評(píng)分為1+、2+或3+，則被歸類為WEE1陽性。

2 結(jié) 果

2.1WEE1在不同胃部病變組織中的表達(dá) WEE1在胃癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)，總體陽性率為43.2%(32/74)。在正常胃組織中陽性率為8.8%(3/34)。在癌前病變組織中的總體陽性率為21.9%(7/32)，其中腸型化生、異型增生、慢性萎縮性胃炎的陽性率分別為25.0%(5/20)、12.5%(1/8)、25.0%(1/4)。WEE1在胃癌組織中的陽性率高于正常胃組織及癌前病變組織(χ2=12.600、5.895，均P<0.05)。見表1、圖1。

表1 WEE1在不同胃部病變組織中的表達(dá)(n)

2.2WEE1表達(dá)與胃癌病理參數(shù)的關(guān)系 腫瘤最大徑、T分期、N分期、脈管浸潤(rùn)對(duì)WEE1表達(dá)有影響(P<0.05)，但腫瘤部位、WHO分型、Lauren分型、M分期對(duì)WEE1表達(dá)無明顯影響(P>0.05)。見表2。

2.3WEE1表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響 對(duì)74例胃癌患者進(jìn)行隨訪，6例患者失訪，均為WEE1陰性患者；5年內(nèi)胃癌患者死亡41例，其中，WEE1陰性組13例、WEE1陽性組28例，2組患者的5年生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=32.690，P<0.05)。見表3。

注：A為WEE1在正常胃組織中的陰性表達(dá)；B為WEE1在正常胃組織中的陽性表達(dá)；C為WEE1在腸型化生胃組織中的陰性表達(dá)；D為WEE1在腸型化生胃組織中的陽性表達(dá)；E為WEE1在胃癌組織中的陰性表達(dá)；F為WEE1在胃癌組織中的陽性表達(dá)。

表2 WEE1表達(dá)與胃癌病理參數(shù)的關(guān)系(n)

續(xù)表2 WEE1表達(dá)與胃癌病理參數(shù)的關(guān)系(n)

表3 WEE1表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響

3 討 論

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活習(xí)慣、飲食習(xí)慣發(fā)生巨大改變，胃癌的發(fā)病率明顯升高，尋找治療胃癌的分子靶點(diǎn)有重要意義[7-8]。WEE1激酶是一種在細(xì)胞有絲分裂前G2～M期檢查點(diǎn)阻滯中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶類[9-10]。正常細(xì)胞在G1期修復(fù)DNA，但腫瘤細(xì)胞伴有G1～S期檢查點(diǎn)缺陷，通常依賴G2～M期檢查點(diǎn)完成DNA修復(fù)，這為靶向WEE1激酶抑制的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)[11-12]。臨床研究證實(shí)，WEE1抑制劑AZD1775對(duì)一線治療抵抗或耐藥的TP53突變卵巢癌患者有效[13]，但在胃癌中，WEE1的相關(guān)研究尚處于起步階段。

本研究選取了74例胃癌患者、32例癌前病變患者、34例胃部良性疾病患者為研究對(duì)象，采用免疫組化法檢測(cè)胃部病變組織及正常組織中WEE1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WEE1在胃癌、癌前病變、正常胃組織的陽性率分別為43.2%(32/74)、21.9%(7/32)、8.8%(3/34)，胃癌組織中的陽性率高于正常胃組織及癌前病變組織(P<0.05)。與其他研究不同，本研究遵循胃癌的自然發(fā)生模式，即“正常組織-癌前病變-胃癌”模式進(jìn)行WEE1檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢出率呈明顯升高趨勢(shì)。這表明，隨著WEE1表達(dá)強(qiáng)度的升高，機(jī)體對(duì)正常胃黏膜轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒约?xì)胞的抑制能力減弱，細(xì)胞發(fā)生惡性增殖的能力變強(qiáng)，促進(jìn)了胃癌的發(fā)生。本研究進(jìn)一步分析了WEE1表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤最大徑、T分期、N分期、脈管浸潤(rùn)對(duì)WEE1表達(dá)有影響。這提示臨床，WEE1的表達(dá)上調(diào)可能參與了胃癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)。這可能是由于：(1)WEE1陽性意味著胃癌細(xì)胞有更強(qiáng)大的分化增殖能力，致使腫瘤細(xì)胞更易生長(zhǎng)、侵入淋巴管或血管，造成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移。(2)脈管癌栓與胃癌分期有密切關(guān)系，WEE1可能通過促進(jìn)脈管癌栓從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究隨訪發(fā)現(xiàn)，WEE1陽性患者死亡28例，WEE1陰性患者死亡13例。與WEE1陰性患者比較，WEE1陽性患者5年生存率較差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。WEE1陽性患者無瘤生存期低于WEE1陰性患者(P<0.05)。這與WEE1對(duì)臨床病理參數(shù)影響的結(jié)論相吻合。WEE1的陽性表達(dá)意味著更高的T分期與N分期，同時(shí)也可能導(dǎo)致脈管浸潤(rùn)的發(fā)生率升高。這些不良因素共同作用，致使WEE1陽性患者預(yù)后明顯較差、無瘤生存期較短。相應(yīng)地，WEE1陰性患者預(yù)后較好。

綜上所述，WEE1在胃癌中有較高的陽性率，且與胃癌分期密切相關(guān)，其陽性表達(dá)是患者預(yù)后不良的強(qiáng)烈信號(hào)。但本研究為單中心研究，樣本量較小，未來在多中心聯(lián)合的基礎(chǔ)上，實(shí)施更大樣本量的研究，或能得出更具說服力的證據(jù)。