吳重陽(yáng)，敖科萍，王遠(yuǎn)芳，吳思穎，王旻晉，肖玉玲，李冬冬，謝 軼，應(yīng)斌武

四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川成都 610041

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在全球范圍內(nèi)迅速蔓延[1-3]。臨床診斷基于流行病學(xué)史、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)和肺部CT檢查，COVID-19確診主要依賴(lài)于病毒核酸的測(cè)定。然而核酸檢測(cè)操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)及存在假陰性等問(wèn)題，可導(dǎo)致診斷延遲，因此需要其他方法彌補(bǔ)核酸檢測(cè)的不足[4]?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第七版)》[5]中明確指出新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)特異性抗體陽(yáng)性為COVID-19的確診標(biāo)準(zhǔn)之一，目前已有針對(duì)SARS-CoV-2的免疫球蛋白(Ig)M和IgG抗體的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和膠體金檢測(cè)試劑盒[6]，可對(duì)臨床疑似患者進(jìn)行篩查，以完善實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目。本研究以膠體金法與ELISA檢測(cè)SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體的臨床診斷價(jià)值為研究點(diǎn)進(jìn)行比較分析，了解2種試劑盒在檢測(cè)不同病程COVID-19患者血清病毒抗體的靈敏度和特異度，并評(píng)價(jià)方法學(xué)的一致性和可靠性。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者診斷參照國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)制訂的《關(guān)于新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[7]執(zhí)行，根據(jù)2次以上核酸檢測(cè)結(jié)果將2020年1-2月在本院住院的患者分為確診患者組38例，有典型的臨床癥狀和肺部影像學(xué)特征，2次以上核酸結(jié)果陽(yáng)性；疑似患者組43例，連續(xù)2次(間隔24 h以上)核酸檢測(cè)結(jié)果陰性，合并其他呼吸道細(xì)菌或病毒感染。本研究已通過(guò)四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理審查，倫理批準(zhǔn)文號(hào)2020年審(429)號(hào)。

1.2儀器與試劑 SARS-CoV-2特異性抗體IgM和IgG的ELISA檢測(cè)試劑盒和膠體金法檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自珠海麗珠試劑股份有限公司。IgM抗體檢測(cè)根據(jù)捕獲法原理，以抗人IgM-μ鏈(包被二抗)包被微孔板，IgG抗體檢測(cè)根據(jù)間接法原理，以重組SARS-CoV-2抗原(包被抗原)包被微孔板，嚴(yán)格按照生物安全要求和試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作和結(jié)果判斷。

1.3病毒抗體動(dòng)態(tài)變化 選擇13例患者的不同感染時(shí)間點(diǎn)的血清標(biāo)本，研究時(shí)間是從患者入院后第一次采集的血清標(biāo)本開(kāi)始，病程計(jì)算是從患者有發(fā)熱、咳嗽等臨床癥狀到檢測(cè)血清抗體的時(shí)間，以核酸檢測(cè)結(jié)果為參照，觀察病毒抗體動(dòng)態(tài)變化。核酸檢測(cè)所用引物、試劑和方法參考文獻(xiàn)[8]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。靈敏度、特異度等指標(biāo)的比較使用配對(duì)資料χ2檢驗(yàn)，采用Kappa值評(píng)價(jià)2種檢測(cè)方法的一致性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1臨床特異度評(píng)價(jià) 43例疑似患者中，膠體金法試劑盒檢測(cè)IgM、IgG抗體均有40例陰性，3例假陽(yáng)性，臨床特異度為93.02%(40/43)；ELISA試劑盒檢測(cè)IgM、IgG抗體均有42例陰性，1例假陽(yáng)性，臨床特異度為97.67%(42/43)；其中1例患者有發(fā)熱、咳嗽、咳痰等臨床癥狀，呼吸道13種病毒篩查結(jié)果顯示SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，膠體金法和ELISA同時(shí)檢測(cè)2種特異性抗體均為陽(yáng)性；2例膠體金法檢測(cè)結(jié)果為弱陽(yáng)性的患者無(wú)任何COVID-19臨床表現(xiàn)，僅表現(xiàn)為普通病毒感冒癥狀，核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明這2種抗體檢測(cè)試劑盒有較高的臨床特異度，能夠滿(mǎn)足COVID-19的篩查和診斷要求。

2.2臨床靈敏度評(píng)價(jià) 38例確診患者中，膠體金法試劑盒檢測(cè)IgM、IgG抗體的靈敏度分別為63.16%(24/38)、76.32%(29/38)；IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)(IgM和IgG抗體任一陽(yáng)性即確定為陽(yáng)性)陽(yáng)性30例，聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為78.95%(30/38)；ELISA試劑盒檢測(cè)IgM、IgG抗體靈敏度分別為55.26%(21/38)、60.53%(23/38)；IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性27例，聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為71.05%(27/38)。結(jié)果表明，SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)在COVID-19患者中具有較高的檢出率，是核酸檢測(cè)漏檢的良好補(bǔ)充。

2.32種方法檢測(cè)確診患者不同病程血清IgM和IgG抗體結(jié)果比較 13例不同感染時(shí)間點(diǎn)的確診患者，其中男7例，女6例，年齡19～81歲。13例確診患者病程<3 d時(shí)IgM抗體均為陰性，當(dāng)病程≥7 d時(shí)，膠體金法檢測(cè)IgM、IgG抗體的陽(yáng)性率均高于ELISA。見(jiàn)表1。

表1 2種方法檢測(cè)確診患者不同病程血清IgM和IgG抗體結(jié)果比較[n(%)]

2.4膠體金法和ELISA檢測(cè)結(jié)果比較 81例研究對(duì)象的ELISA和膠體金法檢測(cè)特異性抗體IgM和IgG結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.745、0.805，均P>0.05)。疑似患者組中有1例患者血清的特異性抗體IgG為弱陽(yáng)性，IgM為陰性，且呼吸道13種病毒檢測(cè)中的SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性，結(jié)合影像學(xué)和血細(xì)胞分析結(jié)果，考慮不支持COVID-19，為假陽(yáng)性。

3 討 論

目前，SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性雖是疑似患者確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果易受標(biāo)本質(zhì)量、病毒感染部位及表達(dá)量等眾多因素影響，因而核酸單項(xiàng)檢測(cè)不能滿(mǎn)足疫情期間對(duì)疑似患者快速篩查的要求[9]。一些符合臨床表現(xiàn)和肺部CT檢出結(jié)果的COVID-19疑似患者，其不同標(biāo)本類(lèi)型(咽拭子、肺泡灌洗液、糞便等)多次核酸檢測(cè)結(jié)果陰性，因此這些患者進(jìn)行抗體檢測(cè)或可提高診斷效率[10-11]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，包括病毒特異性抗體(IgM和IgG)在內(nèi)的血清學(xué)應(yīng)答可以進(jìn)行血清學(xué)診斷。通常IgM抗體在感染早期出現(xiàn)，在SARS-CoV-2感染中最早可在第3天就檢測(cè)到，所以其結(jié)果可以作為早期診斷指標(biāo)[12-13]。核酸檢測(cè)是確診SARS-CoV-2感染的最重要方法，但是該方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，操作步驟復(fù)雜且靈敏度不高，因此，SARS-CoV-2抗體檢測(cè)方法逐漸被開(kāi)發(fā)。目前已有研究開(kāi)始探索SARS-CoV-2 IgM、IgG和總抗體檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值，LI等[14]對(duì)新研發(fā)的免疫層析法IgM和IgG抗體快速檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示其靈敏度和特異度分別為88.66%和90.63%。本研究中采用的ELISA和膠體金法檢測(cè)COVID-19確診患者IgM、IgG抗體特異度較高，進(jìn)一步確認(rèn)了SARS-CoV-2抗體檢測(cè)可為核酸檢測(cè)結(jié)果陰性患者的確診提供輔助診斷。

本研究中1例患者經(jīng)過(guò)多次核酸檢測(cè)得以確診，其在住院過(guò)程中多次采集咽拭子、糞便及肺泡灌洗液進(jìn)行核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性，筆者在對(duì)該患者血清抗體連續(xù)監(jiān)測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，膠體金法和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示IgM和IgG抗體陽(yáng)性，且病程≥5 d后在血清中檢測(cè)到IgM/IgG抗體。在該患者發(fā)病7 d之后，ELISA檢測(cè)IgG抗體滴度開(kāi)始增加。還有1例患者為家族聚集性病例，該患者顯示家族中4名成員均有COVID-19的典型臨床癥狀和明確的流行病學(xué)史，該患者的兒子、丈夫、兒媳因核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性確診，但該患者核酸檢測(cè)結(jié)果持續(xù)陰性而血清特異性抗體IgM/IgG結(jié)果均為陽(yáng)性，同時(shí)該患者年齡大、基礎(chǔ)疾病多(合并慢性阻塞性肺疾病、高血壓等)，入院后多次采集肺泡灌洗液標(biāo)本困難，只能采集鼻咽拭子或糞便標(biāo)本，核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性。筆者采用膠體金法對(duì)該患者進(jìn)行連續(xù)性血清特異性抗體檢測(cè)，顯示在入院3 d后IgM抗體轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，10 d后IgG抗體轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。血清特異性抗體檢測(cè)窗口期與SARS-CoV-2核酸檢測(cè)類(lèi)似，而膠體金法對(duì)標(biāo)本質(zhì)量的要求不如核酸檢測(cè)嚴(yán)格，當(dāng)在呼吸道標(biāo)本中檢測(cè)不到病毒核酸時(shí)，但可以檢測(cè)到特異性抗體的存在。因此以上2例患者得以通過(guò)臨床癥狀和早期抗體檢測(cè)結(jié)果確診，可避免核酸檢測(cè)中因采樣要求高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)和操作步驟繁瑣等問(wèn)題導(dǎo)致的假陰性結(jié)果出現(xiàn)，同時(shí)表明血清抗體的檢測(cè)可以在一定程度上彌補(bǔ)核酸檢測(cè)漏檢的風(fēng)險(xiǎn)[15]。雖然病毒核酸可在COVID-19患者1～5 d上呼吸道咽拭子中檢出，但受病毒感染機(jī)制及采樣部位影響，仍然存在上呼吸道咽拭子核酸檢測(cè)結(jié)果陰性，臨床癥狀及流行病史和實(shí)驗(yàn)室其他檢查數(shù)據(jù)又高度懷疑COVID-19的情況。因此，抗體聯(lián)合核酸檢測(cè)可有助于進(jìn)一步提高SARS-CoV-2感染的檢出率，有助于彌補(bǔ)核酸檢測(cè)的不足。

本研究中，2種方法檢測(cè)IgM抗體的靈敏度均不高，可能有以下原因：(1)確診患者數(shù)量有限，對(duì)檢測(cè)方法的應(yīng)用評(píng)價(jià)還不全面，無(wú)法更準(zhǔn)確地反映試劑盒的診斷效能；(2)觀察時(shí)間點(diǎn)不統(tǒng)一，需要對(duì)患者進(jìn)行連續(xù)長(zhǎng)時(shí)間追蹤觀察。通過(guò)分析13例住院患者病程及所有COVID-19確診患者血清抗體檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)IgG抗體的陽(yáng)性率要高于IgM抗體，這一研究結(jié)果與徐萬(wàn)洲等[16]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致。可能與患者所處的感染時(shí)期及IgM抗體是稀釋后檢測(cè)有關(guān)，同時(shí)受到標(biāo)本數(shù)量和試劑制備的影響。2種方法檢測(cè)抗體的特異度均≥90%，可能是由于COVID-19為新發(fā)疾病，目前人群普遍易感，血清中特異性抗體水平總體較低。同時(shí)，確診患者中存在核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性而抗體檢測(cè)結(jié)果陰性的情況，這可能與患者產(chǎn)生抗體的生理過(guò)程有關(guān)。由于抗體的產(chǎn)生都有窗口期，當(dāng)患者血清中的抗體還未產(chǎn)生或水平低于檢測(cè)下限，那么此時(shí)免疫學(xué)方法就無(wú)法對(duì)其進(jìn)行有效檢測(cè)。此外，在本研究中疑似患者組膠體金的弱陽(yáng)性例數(shù)較多，其中1例患者呼吸道SARS-CoV-2核酸結(jié)果陽(yáng)性，而膠體金法檢測(cè)IgM抗體結(jié)果陰性，IgG抗體結(jié)果弱陽(yáng)性。冠狀病毒的核衣殼(N)蛋白相對(duì)保守，來(lái)自冠狀病毒Ⅰ型抗原的多克隆抗體，包括人冠狀病毒229E、貓傳染性腹膜炎病毒和豬傳染性胃腸炎病毒都與SARS-CoV感染的Vero細(xì)胞有關(guān)。表明SARS-CoV的N蛋白與抗原性Ⅰ類(lèi)動(dòng)物冠狀病毒的抗血清發(fā)生抗原性交叉反應(yīng)[17]。因此，本研究所使用完整的N蛋白作為包被抗原進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)可能會(huì)影響靈敏度和特異度，這也可能是在本研究中所使用的膠體金試劑盒檢測(cè)IgG抗體的靈敏度高于IgM抗體的原因。因此若抗體檢測(cè)陽(yáng)性時(shí)應(yīng)該動(dòng)態(tài)檢測(cè)抗體滴度，結(jié)合臨床和核酸檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行鑒別診斷，以排除其他冠狀病毒感染的可能性。類(lèi)風(fēng)濕因子、嗜異性抗體、補(bǔ)體及外源性干擾等因素也可能造成試驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性。研究表明當(dāng)患者體內(nèi)存在高類(lèi)風(fēng)濕因子抗體時(shí)，假陽(yáng)性率可高達(dá)60%[18]。

綜上所述，2種方法對(duì)確診和疑似患者的診斷無(wú)明顯差異，在應(yīng)用價(jià)值上各有優(yōu)缺點(diǎn)。膠體金檢測(cè)試劑盒不需要復(fù)雜設(shè)備，具有操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，適用于醫(yī)院急診、門(mén)診、重癥監(jiān)護(hù)室、傳染科等臨床科室快速篩查[19]。對(duì)疑似患者血清標(biāo)本進(jìn)行特異性抗體檢查，增加了COVID-19檢測(cè)手段，有早期預(yù)報(bào)、回顧性診斷和流行病學(xué)研究的意義，對(duì)深入認(rèn)識(shí)疫情的發(fā)生發(fā)展具有重要價(jià)值[20]。