郭 玲，王美玲，葉麗艷，馬艷寧，馬 薇，宋林鍵，葉 坤，楊繼勇

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，北京 100853

腸桿菌科細(xì)菌是引起臨床感染的主要病原菌[1]。碳青霉烯類抗菌藥物抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、毒性低，臨床上常將其作為嚴(yán)重細(xì)菌感染的最佳治療藥物[2]。隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)逐年增多，為臨床抗感染治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)[3]。CRE是指產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌，對(duì)多利培南、厄他培南、亞胺培南或美羅培南耐藥[4]。由于CRE傳播速度快、致死率高，世界衛(wèi)生組織將CRE列為21世紀(jì)最重要的耐藥病原菌之一[5]。

為了解近2年CRE的檢出情況，本研究分析了2017-2018年本院臨床分離的CRE的分布、藥物敏感性特征及攜帶常見耐藥基因情況，以期為醫(yī)院感染控制和臨床抗菌藥物的合理使用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2017-2018年臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌，選擇其中對(duì)亞胺培南或厄他培南耐藥的CRE。

1.2儀器與試劑 VITEK MS質(zhì)譜儀和VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀及配套試劑均購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司。

1.3方法 對(duì)CRE進(jìn)行分離培養(yǎng)；采用VITEK MS質(zhì)譜儀或VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定；采用VITEK 2 Compact革蘭陰性桿菌藥敏卡進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。采用煮沸法提取待測(cè)菌株DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，確定菌株是否攜帶目前已知的常見碳青霉烯類耐藥基因。部分?jǐn)U增產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在GenBank中與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的種類和型別。引物序列來(lái)自于文獻(xiàn)[6],具體序列見表1。

1.4質(zhì)量控制 大腸埃希菌ATCC8739、銅綠假單胞菌ATCC27853為藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株，肺炎克雷伯菌ATCC1705為blaKPC陽(yáng)性質(zhì)控菌株，均購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，檢出率與耐藥率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 常見碳青霉烯酶基因引物序列

2 結(jié) 果

2.12017年和2018年不同菌種的CRE檢出率比較 本院共分離出腸桿菌科細(xì)菌8 006株，CRE檢出率為9.3%(745/8 006)，其中2017年CRE檢出率為9.6%(383/3 976)，2018年CRE檢出率為9.0%(362/4 030)，2017年和2018年陰溝腸桿菌的CRE檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；745株CRE中，肺炎克雷伯菌占81.5%(607/745)，大腸埃希菌占7.2%(54/745)，陰溝腸桿菌占4.0%(30/745)，產(chǎn)酸克雷伯菌占1.5%(11/745)，產(chǎn)氣腸桿菌占1.3%(10/745)。其中肺炎克雷伯菌中的CRE檢出率達(dá)到了24.3%(607/2 495)。見表2。

表2 2017年和2018年不同菌種的CRE檢出率比較

2.2CRE的科室分布 745株CRE主要分離自各科的監(jiān)護(hù)室(334/745，44.8%)、外科病區(qū)(217/745，29.1%)及內(nèi)科病區(qū)(111/745，14.9%)。其中CRE檢出率最高的前5個(gè)病區(qū)分別為急診科監(jiān)護(hù)室(79/193，40.9%)、呼吸內(nèi)科監(jiān)護(hù)室(55/135，40.7%)、神經(jīng)內(nèi)科監(jiān)護(hù)室(82/204，40.2%)、呼吸內(nèi)科病區(qū)(72/252，28.6%)和腎病監(jiān)護(hù)室(15/76，19.7%)。見表3。

2.3CRE的來(lái)源分布 745株CRE主要來(lái)源于呼吸道標(biāo)本(339/745，45.5%)、引流液(99/745，13.3%)、尿液(89/745，11.9%)、靜脈血(65/745，8.7%)、組織(45/745，6.0%)等。CRE檢出率最高的標(biāo)本分別是引流液(99/493，20.1%)、腹水(21/115，18.3%)及呼吸道標(biāo)本(339/1 867，18.2%)。見表4 。

表3 CRE的科室分布

2.4CRE對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率 在臨床常用的14種抗菌藥物中，CRE對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑、阿米卡星和呋喃妥因的耐藥率稍低，耐藥率分別為42.3%、47.7%和55.4%，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率均>80.0%；不同菌種對(duì)抗菌藥物的耐藥率不同，肺炎克雷伯菌的耐藥率相對(duì)較高，除復(fù)方磺胺甲噁唑、阿米卡星和呋喃妥因外，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率均>90.0%。見表5。

2.5CRE中碳青霉烯酶基因分布 對(duì)CRE進(jìn)行碳青霉烯酶基因檢測(cè)和分析，86.3%(643/745)的菌株攜帶碳青霉烯酶基因，主要為blaKPC(551/745，74.0%)、blaNDM-1(67/745，9.0%)和blaOXA-48(14/745，1.9%)。攜帶碳青霉烯酶基因的643株CRE中各基因的構(gòu)成比分別為：blaKPC占85.7%(551/643)、blaNDM-1占10.4%(67/643)、blaIMP占1.9%(12/643)、blaVIM占0.9%(6/643)和blaOXA-48占2.2%(14/643)；含2種及2種以上碳青霉烯酶基因的有7株，檢出率為1.1%。肺炎克雷伯菌株中，檢出率最高的碳青霉烯酶基因?yàn)閎laKPC(86.8%，527/607)，而大腸埃希菌和陰溝腸桿菌中，檢出率最高的均為blaNDM-1，檢出率分別為44.4%(24/54)和33.3%(10/30)。見表6。

表4 CRE的來(lái)源分布

表5 CRE對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率

續(xù)表5 CRE對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率

表6 CRE中碳青霉烯酶基因分布(n)

細(xì)菌種類混合基因型別blaKPC+blaVIMblaKPC+blaIMPblaKPC+blaNDM-1blaKPC+blaOXA-48肺炎克雷伯菌--31大腸埃希菌----陰溝腸桿菌11--產(chǎn)氣腸桿菌----黏質(zhì)沙雷菌----產(chǎn)酸克雷伯菌-1--摩氏摩根菌----其他腸桿菌屬----合計(jì)1231

3 討 論

本研究顯示，2017-2018年本院共檢出CRE 745株，總檢出率為9.3%，與國(guó)內(nèi)平均水平(1.2%～15.5%)基本一致[7-9]；與本院2016年CRE的檢出率(6.4%)[10]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示本院臨床CRE檢出率呈上升趨勢(shì)。其中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的檢出率為24.3%，與2016年比較，也有明顯上升趨勢(shì)，耐碳青霉烯類大腸埃希菌檢出率為1.5%，與2008-2016年比較，上升趨勢(shì)明顯[10]。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的流行和傳播仍然是導(dǎo)致本院CRE檢出率快速上升的主要原因，與國(guó)內(nèi)報(bào)道一致[7-9]。有研究指出可以通過(guò)合理使用抗菌藥物，采集患者的糞便等標(biāo)本進(jìn)行CRE主動(dòng)篩查，防止CRE的傳播和流行[7]。英國(guó)醫(yī)療感染學(xué)會(huì)聯(lián)合工作小組2015年11月發(fā)布了對(duì)多重革蘭陰性菌的防控建議，建議高風(fēng)險(xiǎn)人群主動(dòng)篩查CRE，及早主動(dòng)篩查CRE并進(jìn)行干預(yù)，能有效降低患者的感染率和病死率[11]。醫(yī)院目前的防控手段無(wú)法有效遏制CRE的傳播，因此，進(jìn)一步明確CRE的傳播規(guī)律，繼續(xù)監(jiān)測(cè)CRE的耐藥變化，并在此基礎(chǔ)上有效防控刻不容緩。

本研究從科室分布分析，本院2年分離到的745株CRE主要分布于各科監(jiān)護(hù)室(44.8%)，其原因可能與監(jiān)護(hù)室患者病情較嚴(yán)重、基礎(chǔ)疾病多、住院時(shí)間長(zhǎng)、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用、抗菌藥物使用劑量大、過(guò)多涉及侵入性操作等危險(xiǎn)因素有關(guān)[12]。監(jiān)護(hù)室和呼吸科的患者與其他科室患者比較，較頻繁地接受機(jī)械性通氣和侵入性操作，使原本定植在氣道的病原菌侵入并造成感染。因此，臨床工作人員應(yīng)根據(jù)患者病情進(jìn)行評(píng)估，盡早讓患者脫離呼吸機(jī)或采用無(wú)創(chuàng)性機(jī)械通氣，以免增加上述高?？剖一颊逤RE感染機(jī)會(huì)。

本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，CRE除對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑、阿米卡星和呋喃妥因的耐藥率稍低外，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率均>80.0%，說(shuō)明本院臨床分離的CRE耐藥狀況嚴(yán)重，因此臨床如果經(jīng)驗(yàn)性選用抗菌藥物時(shí)可首先考慮這3種抗菌藥物。但使用阿米卡星需要慎重，有報(bào)道顯示，應(yīng)用氨基糖胺類藥物治療CRE感染時(shí)，其細(xì)菌清除率為88%，高于多黏菌素(64%)和替加環(huán)素(43%)，但由于其治療劑量與中毒劑量接近，不良反應(yīng)較大[13]。研究發(fā)現(xiàn)某些聯(lián)合用藥或者新的酶抑制劑復(fù)合藥物對(duì)CRE的感染治療有效，但目前還需要大樣本的隨機(jī)對(duì)照研究為其提供有力依據(jù)[14-15]。應(yīng)進(jìn)一步探討治療CRE的藥物(如替加環(huán)素、含酶抑制劑類、多黏菌素、磷霉素等)單藥或者聯(lián)合使用時(shí)藥敏試驗(yàn)效果，為臨床提供參考[16-17]。

在CRE的諸多耐藥機(jī)制中，最重要的是產(chǎn)碳青霉烯酶。根據(jù)Ambler分類法將細(xì)菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶分為A、B、D三類[18]。本研究中檢測(cè)的KPC酶屬于A類碳青霉烯酶，IMP、VIM及NDM酶屬于B類金屬酶，OXA-48酶屬于D類苯唑西林酶。KPC酶在全世界廣泛流行，亞洲地區(qū)主要是KPC-2型，是目前研究最多也最常見的一種碳青霉烯酶，主要在肺炎克雷伯菌中檢出，在大腸埃希菌、產(chǎn)酸克雷伯菌等也有檢出[19]。本研究中blaKPC基因型的檢出率為74.0%，其中在肺炎克雷伯菌中占86.8%。在中國(guó)ST11型肺炎克雷伯菌是KPC基因的優(yōu)勢(shì)菌種，檢出率逐年上升，與ST11型KPC菌株的傳播及blaKPC基因的傳播方式有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)blaKPC可通過(guò)轉(zhuǎn)座子在不同質(zhì)粒間傳播進(jìn)而在不同菌株間傳播[20]，但本研究CRE高檢出菌株是否屬于ST11型及KPC基因的傳播特點(diǎn)仍需要進(jìn)一步研究。在本研究中，與blaKPC基因型在肺炎克雷伯菌檢出率最高不同，blaNDM-1基因型是大腸埃希菌和陰溝腸桿菌等耐碳青霉烯類藥物的主要基因型，其檢出率分別為44.4%和33.3%。目前產(chǎn)NDM的有1～21個(gè)亞型，流行區(qū)域不同，進(jìn)一步明確亞型有助于了解其流行病學(xué)特征。除此之外，本研究共檢測(cè)出7例混合基因型CRE，其中肺炎克雷伯菌4株，陰溝腸桿菌2株，產(chǎn)酸克雷伯菌1株?；旌匣蛐蛿y帶的主要基因?yàn)閎laKPC基因。

綜上所述，2017-2018年本院CRE數(shù)量和檢出率仍然呈上升趨勢(shì)，CRE對(duì)臨床常用抗菌藥物呈現(xiàn)較高的耐藥率。應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)院內(nèi)感染控制，遏制CRE的傳播，同時(shí)提供可能有效的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥。