王萌萌，熊 丹，湯花梅，張水蘭，闞麗娟，豆小文，李 悅，宗曾艷，張秀明△

1.廣東省深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，廣東深圳 518001；2.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南 232001

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)核酸檢測系統(tǒng)是一種將PCR與MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)相結(jié)合用于高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)分型診斷的新方法。該法由多重PCR反應(yīng)、單堿基延伸和飛行時間質(zhì)譜分析三步構(gòu)成，可準(zhǔn)確快速地實現(xiàn)多基因多位點檢測[1]。本研究依據(jù)《人乳頭瘤病毒(HPV)核酸檢測及基因分型、試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》[2]、醫(yī)學(xué)實驗室檢測系統(tǒng)性能評價的相關(guān)要求和參考文件，對MALDI-TOF MS 檢測系統(tǒng)檢測18種HR-HPV核酸的準(zhǔn)確度、檢測下限和抗交叉反應(yīng)能力進行評價，并將其檢測結(jié)果與Cobas4800和之江HR-HPV 2種實時熒光定量PCR(qPCR)檢測系統(tǒng)進行一致性評價，以期為病原體核酸質(zhì)譜檢測性能驗證提供重要參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年9-11月在深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院進行宮頸癌篩查的患者的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，初篩選取347份宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，其中羅氏保存液收集標(biāo)本180份，之江保存液收集標(biāo)本167份，標(biāo)本保存在-80 ℃冰箱。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)剩余標(biāo)本量>2 mL的標(biāo)本；(2)收集的陽性標(biāo)本需涵蓋HPV16、18型及其他12種羅氏檢測型別。排除標(biāo)準(zhǔn)：影響檢測結(jié)果的標(biāo)本，如紅細(xì)胞水平過高的標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 Cobas x480全自動核酸提取儀、Cobas z480 qPCR儀及其配套試劑盒均購自美國羅氏公司；Autrax全自動核酸提取工作站及其配套試劑盒購自上海之江公司；Smart32半自動核酸提取儀、Applied Biosystems Veriti 384 qPCR擴增儀、Heraeus fresco 21離心機均購自美國Thermo Fisher Scientific公司； DR MassArray MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)及HPV分型核酸檢測試劑盒購自廣州達(dá)瑞公司；SLAN-96S全自動qPCR儀購自上海宏石公司；Eppendorf移液槍購自德國Eppendorf公司；Vortex-Genie2 漩渦混合器購自美國Scientific Industries公司；Magen磁珠血液快速提取試劑盒購自廣州美基公司。

1.3方法

1.3.1DNA提取及擴增 所有標(biāo)本檢測和儀器操作均嚴(yán)格按照廠家說明書和相應(yīng)儀器的標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序進行。(1)MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)：采用Magen磁珠血液快速提取試劑盒和Smart32半自動核酸提取儀提取HPV-DNA。核酸擴增使用Applied Biosystems Veriti 384 qPCR擴增儀，根據(jù)廠商試劑說明書設(shè)置相應(yīng)反應(yīng)程序，采用MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)對擴增好的產(chǎn)物進行HPV分型檢測。(2)之江檢測系統(tǒng)：采用上海之江核酸提取試劑和擴增試劑在Autrax全自動核酸提取工作站進行HPV-DNA提取和加樣，SLAN-96S全自動qPCR儀用于核酸擴增；(3)Cobas4800檢測系統(tǒng)：使用Cobas4800核酸提取和擴增試劑在Cobas x480全自動核酸提取儀進行HPV-DNA提取和加樣，核酸擴增在Cobas z480 qPCR儀上進行。

1.3.2準(zhǔn)確度評價 采用MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)對隨機選取的40份宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本的18種HR-HPV型別進行檢測，將其檢測結(jié)果與Sanger測序法結(jié)果進行比對，通過比較二者檢測結(jié)果的一致性，分析MALDI-TOF MS檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3.3檢測下限評價 取18種HPV型別重組質(zhì)粒(購自廣州達(dá)瑞診斷公司)，原濃度106copy/mL進行10倍梯度稀釋，最終得到105、104、103、102、10 copy/mL，共5個濃度梯度，18種型別每個梯度重復(fù)檢測10次。評價每個梯度各個型別的檢出情況。根據(jù)《人乳頭瘤病毒(HPV)核酸檢測及基因分型、試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》[2]關(guān)于檢測下限的標(biāo)準(zhǔn)，10次擴增結(jié)果檢出的總陽性符合率為100.00%，則符合標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.4精密度評價 依據(jù)《人乳頭瘤病毒(HPV)核酸檢測及基因分型、試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》[2]精密度評價標(biāo)準(zhǔn)，選取HPV16、18型2個型別的陽性參考品(每份參考品均稀釋成104、102copy/mL 2個濃度梯度)和1份陰性參考品，分別代表強陽性、臨界陽性和陰性標(biāo)本進行質(zhì)譜檢測分析，每個型別每天檢測2次，連續(xù)測定5 d。評價2個HPV型別檢測的批間精密度；各型別同一批次檢測10次，評價2個型別檢測的批內(nèi)精密度。

1.3.5抗交叉反應(yīng)能力評價 將常見的HPV型別(如HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81型和CP8304、83型)及種屬相近或引起癥狀相似的其他病原體(如沙眼衣原體、解脲脲原體、單純皰疹病毒2型、巨細(xì)胞病毒、梅毒螺旋體、淋球菌、白色念珠菌、陰道毛滴蟲等)加入到10份HPV檢測結(jié)果為陰性的標(biāo)本內(nèi)進行擴增，每個標(biāo)本重復(fù)檢測3次，評價外源性干擾物對質(zhì)譜分析結(jié)果的影響。

1.3.6方法學(xué)比較 根據(jù)各廠商說明書對初篩選取的347份宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本進行檢測，記錄3種方法的檢測結(jié)果，比較3種檢測結(jié)果的一致性。以Cobas4800檢測系統(tǒng)的結(jié)果為參考，判斷MALDI-TOF MS和之江檢測系統(tǒng)的靈敏度、特異度。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。使用Kappa值比較3種檢測方法的一致性[Kappa值大小所代表的一致性強弱分為6個區(qū)段：一致性弱(<0.00)，一致性微弱(0.00～0.20)，一致性弱(>0.20～0.40)，中度一致(>0.40～0.60)，高度一致(>0.60～0.80)及一致性極強(>0.80～1.00)]，95%CI用于估算Kappa值的二項分布[2-3]；使用Mcnemar檢驗計算P值，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13種HR-HPV檢測方法比較 3種方法中，MALDI-TOF MS檢測限最低，為100 copy/mL，之江檢測系統(tǒng)檢測限最高，為10 000 copy/mL。Cobas 4800檢測系統(tǒng)能夠檢測14種HR-HPV型別但僅能對HPV16型和HPV18型進行分型；之江檢測系統(tǒng)能對15種HR-HPV進行分型測定；MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)可對18種HR-HPV進行分型測定。由于3種方法對HR-HPV的檢測型別略有差異，以下僅對14種HR-HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型)檢測結(jié)果進行比較，且對16型和18型結(jié)果單獨分析，其他12種型別進行合并分析。

2.2MALDI-TOF MS準(zhǔn)確度評價 MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)與Sanger測序法對40份宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本的18種HR-HPV型別檢測的準(zhǔn)確度為100.00%，檢測結(jié)果完全一致，具體檢測型別見表1。

表1 MALDI-TOF MS準(zhǔn)確度驗證結(jié)果

2.3MALDI-TOF MS檢測下限評價 使用18種HR-HPV重組質(zhì)粒為模板，核酸質(zhì)譜檢測顯示1～2個目標(biāo)峰，代表特定HPV型別的擴增產(chǎn)物和未延伸引物，各個型別之間不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。18種HPV型別中HPV26、33、45和56型在103copy/mL的檢出率為100.00%(10/10)，HPV16、18、31、35、39、51、52、53、58、59、66、68、73和82型在102copy/mL的檢出率為100.00%(10/10)。結(jié)果顯示18種型別的HPV檢測下限均在102～103copy/mL。

2.4MALDI-TOF MS精密度評價 HPV16型和HPV18型2個型別在102copy/mL和104copy/mL的總檢出率均為100.00%(20/20)，批內(nèi)和批間精密度均為100.00%(10/10)；陰性參考品的檢出率為0.00%，重復(fù)性為100.00%。表明該質(zhì)譜檢測系統(tǒng)性能穩(wěn)定，滿足HPV核酸的檢測要求。

2.5MALDI-TOF MS抗交叉反應(yīng)能力評價 10份陰性標(biāo)本加入干擾病原體擴增后，MALDI-TOF MS檢測結(jié)果仍為陰性，未出現(xiàn)特征峰，陰性符合率為100.00%(10/10)，表明該檢測方法對非本試劑盒檢測的病原體無交叉反應(yīng)，具有良好的特異度。

2.6臨床標(biāo)本檢測符合率 采用MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)對347份標(biāo)本檢測的陽性率為62.54%(217/347)，之江檢測系統(tǒng)陽性率為61.10%(212/347)，Cobas4800檢測系統(tǒng)陽性率為64.27%(223/347)。3種方法檢測的總符合率為92.51%(321/347)，其中有306份標(biāo)本基因型檢測完全一致(88.18%)。Cobas4800和之江檢測結(jié)果的符合率最低，為92.22%(320/347)，Cobas4800與MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)結(jié)果的符合率為94.81%(329/347)，之江和MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)的符合率最高，為96.83%(336/347)。3種方法對HPV16型和HPV18型檢測的總符合率為98.56%和97.12%，其中之江和MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)對HPV16、18型的檢測符合率高達(dá)98.85%(Kappa=0.965，95%CI0.932～0.993)和98.27%(Kappa=0.917，95%CI0.852～0.982)。見表2。

表2 臨床標(biāo)本檢測結(jié)果(n)

2.7靈敏度和特異度評價 MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)的靈敏度為94.62%，特異度為95.16%，均高于之江檢測系統(tǒng)(靈敏度為91.48%，特異度為93.55%)。

3 討 論

HR-HPV的持續(xù)感染與宮頸上皮病變密切相關(guān)，及時篩查HR-HPV分型是預(yù)防宮頸癌的重要手段。HPV16型與HPV18型不僅在世界范圍內(nèi)高發(fā)，也是發(fā)生宮頸癌風(fēng)險程度最高的2種型別。有研究表明，其他型的HR-HPV感染與地域分布密切相關(guān)，例如在亞洲地區(qū)，HPV52、58型的感染率較高；而在南美等地區(qū)，HPV31型更為流行；此外HPV33、45型是非洲地區(qū)的高發(fā)感染型別[3-5]，因此對HR-HPV進行基因分型檢測和地區(qū)流行性調(diào)查，對HR-HPV感染的風(fēng)險程度判斷、疫苗研發(fā)有重要作用。本研究中Cobas4800檢測系統(tǒng)雖可一次性檢測94份標(biāo)本，但只能區(qū)分HPV16、18型具體分型，不能區(qū)分其他高危型別；之江檢測系統(tǒng)雖能對15種HR-HPV型別進行全部分型但只能單次檢測22份標(biāo)本。以二代基因測序為代表的高通量測序技術(shù)，因其檢測成本高、周期長、質(zhì)控難、操作復(fù)雜、可重復(fù)性不高等因素限制了其在臨床上的大規(guī)模應(yīng)用[6]。新興的MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)填補了中通量HPV-DNA檢測的空缺，又能實現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟的HPV-DNA多基因多位點檢測[7]，本研究使用的MALDI-TOF MS HR-HPV檢測系統(tǒng)可在10 h內(nèi)實現(xiàn)單次檢測192份標(biāo)本，并對這些標(biāo)本的18種HR-HPV準(zhǔn)確分型。

對一個新的檢測系統(tǒng)進行性能驗證是保證檢測質(zhì)量的重要基礎(chǔ)，本研究依據(jù)《人乳頭瘤病毒(HPV)核酸檢測及基因分型、試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》和相關(guān)研究報道[8-10]對MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)進行了準(zhǔn)確度、精密度、檢測下限和抗交叉反應(yīng)能力的性能驗證。研究結(jié)果顯示MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)對于18種HR-HPV檢測的準(zhǔn)確度為100.00%，檢測下限在102～103copy/mL，靈敏度較高。在抗交叉反應(yīng)能力試驗中，MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)對非本試劑盒檢出范圍內(nèi)的常見HPV型別與種屬相近或引起癥狀相似的其他病原體無交叉反應(yīng)，表明該法特異度較高，可滿足臨床和科研對HR-HPV的分型檢測需求。

本研究挑選了347份臨床標(biāo)本對MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)和2種常用的qPCR檢測系統(tǒng)進行了比較。3種方法對347份臨床標(biāo)本檢測的陽性率在61.10%～64.27%，其中Cobas4800檢測系統(tǒng)的陽性率最高(64.27%)，之江檢測系統(tǒng)陽性率最低(61.10%)，可能與檢測限的設(shè)定有關(guān)。本研究標(biāo)本的陽性率偏高，主要原因在于本研究對HPV標(biāo)本的結(jié)果進行了初步篩選，選擇了一定比例的HPV16、18型陽性結(jié)果的標(biāo)本。在已測標(biāo)本符合率的評價中，3種方法對于HPV16型檢測符合率均高于HPV18型，并且結(jié)果顯示3種HPV檢測方法具有高度一致性，其中之江和MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)對HR-HPV分型檢測結(jié)果的符合率最高，Cobas4800和之江檢測系統(tǒng)的符合率最低。目前，由于缺乏真正的HPV檢測金標(biāo)準(zhǔn)，評估新的HPV檢測方法的研究通?；谂c已建立的試驗方法的比較及與疾病終點的相關(guān)性評估[11-13]。Cobas4800 HPV檢測是新開發(fā)的HPV檢測試劑盒分析性能評價的參考方法[13-16],故本研究采用Cobas4800為參比方法，比較之江檢測系統(tǒng)和MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)這2種檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果的靈敏度和特異度。結(jié)果顯示MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)的靈敏度和特異度均高于之江檢測系統(tǒng)。BUSP等[8]發(fā)現(xiàn)基于MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)檢測18種HR-HPV分型的檢測方法具有更高的靈敏度和特異度，本研究結(jié)論與之相符，但其研究僅涉及MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)的建立及對臨床標(biāo)本的分析性能評價，并未對MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)進行性能驗證。本研究不僅涉及MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)對臨床HPV標(biāo)本檢測的分析性能評價，且對MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)進行了系統(tǒng)的性能驗證。

本研究的不足之處在于僅對MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)做了分析性能評價，未結(jié)合標(biāo)本的病理學(xué)結(jié)果進行臨床應(yīng)用評價，且由于標(biāo)本量的限制和方法普及程度無法使用Digene Hybrid Capture 2等已有的參考方法進行驗證。今后擬擴大樣本量并結(jié)合臨床病理學(xué)檢測結(jié)果對MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)的臨床應(yīng)用和性能進行評價。本研究對MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)進行了分析性能驗證和方法的一致性評價，以期為基于MALDI-TOF MS檢測系統(tǒng)開發(fā)病原體傳染性疾病體外診斷試劑盒的性能研究和臨床應(yīng)用評價提供參考依據(jù)