韓 語(yǔ)，王 昕，潘紀(jì)汶，楊 諾，郭桂英，李 遷，曾紀(jì)鋒，鄭繼平

（1.海南大學(xué) 生命科學(xué)與藥學(xué)院，?？?570228; 2.海南大學(xué) 理學(xué)院，?？?570228;3.海南大學(xué) 網(wǎng)絡(luò)與技術(shù)中心，海口 570228; 4.海南大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，海口 570228）

氣單胞菌（Aeromonas）屬于革蘭氏陰性菌，主要存在于各種水生環(huán)境中，分為致病菌株和非致病菌株，致病菌株可感染兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、哺乳類(lèi)、爬行類(lèi)等動(dòng)物，常引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的細(xì)菌性敗血癥[1]，導(dǎo)致養(yǎng)殖的動(dòng)物大量死亡，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的危害。此外，氣單胞菌還可引起人類(lèi)的敗血癥、胃腸炎、傷口感染、腹腔感染、呼吸道感染等疾病[2?3]，引發(fā)嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題。因此，探討鱷魚(yú)源氣單胞菌毒力基因攜帶和耐藥特性的關(guān)系，對(duì)其致病機(jī)制的理解，控制氣單胞菌對(duì)鱷魚(yú)養(yǎng)殖的危害有著重要的意義。自2016 年以來(lái)，海南陵水、文昌等地多家鱷魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了多起暹羅鱷死亡事件，研究人員己從發(fā)病鱷魚(yú)體內(nèi)分離到多株氣單胞菌[4?6]。筆者對(duì)10 株臨床分離到的鱷魚(yú)源氣單胞菌菌株進(jìn)行了相關(guān)的毒力基因和耐藥基因的檢測(cè)以及抗生素藥物敏感性測(cè)定，旨在了解鱷魚(yú)中氣單胞菌毒力基因攜帶和耐藥特性，為探討鱷魚(yú)源氣單胞菌的致病機(jī)制，以及在鱷魚(yú)養(yǎng)殖中該病的有效防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑酵母提取物，蛋白胨來(lái)自英國(guó)OXOID 公司；抗菌藥物藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（Bacterial DNA Isolation Kit）購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；2×F8 Fast Long PCR Master mix 為北京艾德萊生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA 5000 Marker 和DNA 2000 Marker 來(lái)自廣州東盛生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠為法國(guó)Biowest 公司產(chǎn)品。

1.2 氣單胞菌菌株病料樣品來(lái)自于2016—2018 年間海南文昌、陵水地區(qū)鱷魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)的18 月齡以?xún)?nèi)的患病暹羅鱷魚(yú)，經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定，獲得了10 株氣單胞菌臨床菌株，其中，包括5 株嗜水氣單胞菌，3 株達(dá)卡氣單胞菌，1 株簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌和1 株維氏氣單胞菌。

1.3 細(xì)菌基因組提取分別挑取10 株氣單胞菌單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中在30 ℃下培養(yǎng)16 h，然后按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明分別對(duì)10 株氣單胞菌的基因組進(jìn)行提取，通過(guò)Nanophotometer儀器測(cè)定其濃度和純度，然后保存于?20 ℃冰箱中。

1.4 毒力基因的檢測(cè)以分離得到的10 株氣單胞菌的基因組為模板，利用毒力基因檢測(cè)引物（表1）分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，47.4～55.4 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。9 種毒力基因分別為：Ⅲ型分泌系統(tǒng)內(nèi)膜組分基因（Type Ⅲ secretion system inner membrane component,ascV）、ADP?核糖基化毒素基因（ADP-ribosylating toxin,aexT）、胞外毒力因子氣溶素基因（Aerolysin,aer）、細(xì)胞興奮性腸毒素基因（Excitatory enterotoxin,alt）、細(xì)胞毒性腸毒素基因（Cytotoxic enterotoxin,act）、熱穩(wěn)定腸毒素基因（Heat stable enterotoxin,ast）、磷脂酶基因（Lipase,lip）、彈性蛋白酶基因（Elastase,ela）、鞭毛蛋白基因（Flagella,fla）。

表1 氣單胞菌毒力基因引物Tab.1 Primers of Aeromonas virulence genes

1.5 耐藥基因的檢測(cè)以分離得到的10 株氣單胞菌的基因組為模板，利用表2 中的耐藥基因檢測(cè)引物分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，40.0～59.7 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。9 種耐藥基因包括：喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因qnrA、qnrS；四環(huán)素類(lèi)藥物耐藥基因tetA、tetC；氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥基因ant3、strA；磺胺類(lèi)藥物耐藥基因sul1；β?內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥基因tem、ctxM。

1.6 藥敏試驗(yàn)利用紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer 法）進(jìn)行氣單胞菌的抗生素藥物敏感性測(cè)定，通過(guò)產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小判定病原菌對(duì)藥物的敏感性，根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室藥敏操作標(biāo)準(zhǔn)[11]可分為耐藥（R）、中度敏感（I）和高度敏感（S）?？咕幬锼幟艏埰饕é?內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素中青霉素類(lèi)氨芐西林、阿莫西林以及頭孢菌素類(lèi)頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢曲松；氨基糖苷類(lèi)抗生素卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素；四環(huán)素類(lèi)抗生素米諾環(huán)素、四環(huán)素；喹諾酮類(lèi)抗生素依諾沙星、萘啶酸、恩諾沙星、環(huán)丙沙星；磺胺類(lèi)抗生素磺胺異惡唑、甲氧芐啶；糖肽類(lèi)抗生素萬(wàn)古霉素；氯霉素類(lèi)抗生素氯霉素、氟苯尼考；碳青霉烯類(lèi)抗生素亞胺培南。

表2 氣單胞菌耐藥基因引物Tab.2 Primers of antibiotic-resistant genes of Aeromonas

2 結(jié)果與分析

2.1 毒力基因檢測(cè)結(jié)果以10 株氣單胞菌基因組為模板，利用9 種毒力基因的引物分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如表3 所示，除ascV 和aexT 基因陽(yáng)性檢出率較低外，其余7 種毒力基因檢出率均大于50%，其中，lip和ela基因檢出率高達(dá)100%。相比之下，嗜水氣單胞菌中C1、C2、C3 以及維氏氣單胞菌C4 這4 株菌株毒力基因攜帶率較高，可以達(dá)到77.8%。

2.2 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果以10 株氣單胞菌基因組為模板，利用9 種耐藥基因的引物分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（表4）。從表4 可知，9 種耐藥基因陽(yáng)性檢出率偏高，均大于50%。其中，嗜水氣單胞菌C2 和C3 以及簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌C7 這3 株菌里9 種耐藥基因攜帶率高達(dá)100%。

2.3 藥物敏感性從表5 可知，10 株氣單胞菌對(duì)喹諾酮類(lèi)抗生素、四環(huán)素類(lèi)抗生素、氨基糖苷類(lèi)抗生素、氯霉素類(lèi)抗生素和碳青霉烯類(lèi)抗生素的敏感率較高，均大于60%，其中對(duì)慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素、依諾沙星、環(huán)丙沙星和氟苯尼考的敏感率高達(dá)90%以上；而對(duì)于β?內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素、磺胺類(lèi)抗生素和糖肽類(lèi)抗生素耐藥率較高，其中，對(duì)于阿莫西林、頭孢噻吩、頭孢唑啉和萬(wàn)古霉素的耐藥率超過(guò)80%，但對(duì)三代頭孢中的頭孢曲松敏感率較高。

表3 毒力基因鑒定結(jié)果Tab.3 Identification of virulence genes of Aeromonas

表4 耐藥基因鑒定結(jié)果Tab.4 Identification of antibiotic resistant genes of Aeromonas

表5 藥物敏感性鑒定Tab.5 Identification of antibiotic sensitivity

續(xù)表5 Tab. 5 continued

3 討 論

目前，普遍認(rèn)為氣單胞菌致病機(jī)制主要通過(guò)傷口與黏膜系統(tǒng)感染，參與感染的致病因子主要是具粘附作用的鞭毛、菌毛、外膜蛋白。氣單胞菌的致病性強(qiáng)弱與其攜帶的多種毒力因子有關(guān)，毒力因子主要包括胞外毒素（氣溶素、溶血素、細(xì)胞興奮性腸毒素、細(xì)胞毒性腸毒素）、胞外蛋白酶、S 層、菌毛、外膜蛋白、脂多糖等[12]。本研究中，10 株氣單胞菌中的ascV 和aexT 基因檢出率較低，而另外7 種毒力基因檢出率均大于50%，其中，磷脂酶基因lip和彈性蛋白酶基因ela檢出率高達(dá)100%，不同種的氣單胞菌毒力基因攜帶率均偏高。

胡萌[13]和吳亞鋒[14]報(bào)道了氣單胞菌中經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腸毒素相關(guān)基因alt、act陽(yáng)性率在68%以上，攜帶率也較高，而氣溶素基因aer檢出率為47%；范騰飛[15]發(fā)現(xiàn)，58 株氣單胞菌中含腸毒素相關(guān)基因的菌株占24.1%～81%，磷脂酶基因lip檢出率為75.9%，氣溶素基因aer為41.4%；SEN 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，氣單胞菌中l(wèi)ip基因檢出率為88%，alt、act、ast基因檢出率在30%～70%。筆者在本次研究中發(fā)現(xiàn)，氣溶素、腸毒素、蛋白酶等幾種主要毒力基因檢出率較高，都在50%以上，有些甚至達(dá)到100%。多種毒力基因的存在會(huì)大大增強(qiáng)氣單胞菌病原菌的致病性，很可能對(duì)鱷魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害，應(yīng)當(dāng)引起高度重視。

本研究中，耐藥基因檢測(cè)結(jié)果表明，氣單胞菌中9 種耐藥基因陽(yáng)性率都大于50%，其中嗜水氣單胞菌C2 和C3 以及簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌C7 耐藥基因檢出率高達(dá)100%。對(duì)應(yīng)的抗生素藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果與耐藥基因結(jié)果有所不同，藥敏試驗(yàn)中10 株氣單胞菌對(duì)喹諾酮類(lèi)抗生素、四環(huán)素類(lèi)抗生素、氨基糖苷類(lèi)抗生素、氯霉素類(lèi)和碳青霉烯類(lèi)抗生素的敏感率較高，但在耐藥基因檢測(cè)中，均有檢測(cè)出10 株氣單胞菌對(duì)這幾類(lèi)抗生素的耐藥基因。這可能是由于細(xì)菌體內(nèi)復(fù)雜的作用機(jī)制，耐藥基因并沒(méi)有得到順利表達(dá)，這種情況在TRUDEL 等[16]的研究中也有相似的結(jié)果。馬辰婕等[1]通過(guò)檢測(cè)氣單胞菌的耐藥基因，發(fā)現(xiàn)檢出率最高的是β?內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因，陽(yáng)性率高達(dá)83.7%，其次是磺胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)耐藥基因，均高于40%，而喹諾酮類(lèi)耐藥基因qnrB 和qnrS 未檢測(cè)到。在本次實(shí)驗(yàn)中，5 類(lèi)耐藥基因檢出率都偏高，除tetC 外，其余8 種耐藥基因陽(yáng)性率都高于80%。

由于氣單胞菌種類(lèi)繁多，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物受外界環(huán)境以及所用的抗菌藥物種類(lèi)和頻率不同，所以即使同一種氣單胞菌對(duì)藥物的敏感性也有差異。何秋麗[17]發(fā)現(xiàn)，氣單胞菌對(duì)阿莫西林、氨芐西林等耐藥性強(qiáng)，對(duì)二、三代頭孢和碳青霉烯類(lèi)抗生素敏感；李皇[18]等的研究結(jié)果表明，大多數(shù)氣單胞菌對(duì)青霉素耐藥，對(duì)氨基糖苷類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和氯霉素類(lèi)抗生素敏感；CARNAHAN 等[19]報(bào)道了氣單胞菌對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉以及頭孢噻吩耐藥，這些研究結(jié)果與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。暹羅鱷的養(yǎng)殖環(huán)境以及抗生素使用的種類(lèi)和次數(shù)都會(huì)影響到氣單胞菌的藥物敏感性。因此，在鱷魚(yú)細(xì)菌性疾病的防治中，應(yīng)加強(qiáng)耐藥情況的監(jiān)測(cè)，選擇有效的抗菌藥物并交替使用，以減少病原細(xì)菌耐藥率的發(fā)生。

在國(guó)內(nèi)，鱷魚(yú)養(yǎng)殖還是一個(gè)新興產(chǎn)業(yè)，暹羅鱷病原菌方面的研究報(bào)道很有限，鱷魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)要健康發(fā)展，鱷魚(yú)病害研究的重要性不言而喻。本研究從患病暹羅鱷體內(nèi)分離出的10 株氣單胞菌進(jìn)行毒力基因、耐藥基因以及藥物敏感性的檢測(cè)和分析，可為暹羅鱷病害防治及有效的抗菌藥物篩選提供參考。