單金雪，李增平，張 宇，樊雨皇

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570228）

木麻黃（Casuarina equisetifolia）原產(chǎn)于澳大利亞，是一種速生的防風(fēng)常綠喬木[1]，在我國(guó)沿海地區(qū)主要用于防風(fēng)固沙。海南島位于我國(guó)南海北部，因其特殊的地理位置，常遭受臺(tái)風(fēng)的侵襲。因此，海南島從20 世紀(jì)50 年代開(kāi)始大規(guī)模種植木麻黃，通過(guò)營(yíng)造木麻黃人工海防林，全島風(fēng)沙問(wèn)題得到了基本解決。目前，木麻黃已經(jīng)成為海南防護(hù)林建設(shè)中的重要樹(shù)種之一[2]，但以木麻黃為主的海防林容易遭受靈芝屬（Ganoderma）病原木腐菌的侵染，常引起其發(fā)生莖腐或根腐病，造成樹(shù)木死亡[3?4]。在對(duì)海口、澄邁、萬(wàn)寧、昌江沿海和沿江木麻黃防護(hù)林的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，由南方靈芝〔Ganoderma australe(Fr.) Pat.〕引起的莖腐病發(fā)病率為3%～10%，為有效保護(hù)海岸線防護(hù)林，有必要對(duì)引起木麻黃木腐病的病原菌進(jìn)行研究。2004 年，吳興亮等[5]首次對(duì)中國(guó)南方靈芝的地理分布和生境進(jìn)行了報(bào)道。陳禮浪等[4]對(duì)海南木麻黃木腐菌進(jìn)行了研究，共發(fā)現(xiàn)6 種病原靈芝木腐菌，包括南方靈芝。吳如慧[6]對(duì)由二孢假芝（Amauroderma subresinosum）引起的海南木麻黃莖腐病的病原菌進(jìn)行了致病性測(cè)定和生物學(xué)特性研究。目前，尚未見(jiàn)由南方靈芝引起的木麻黃活立木莖腐病的致病性測(cè)定及生物學(xué)研究的報(bào)道。筆者從海南發(fā)病的木麻黃活立木病樹(shù)上采集病樣并進(jìn)行分離培養(yǎng)，對(duì)其病原菌通過(guò)接種完成致病性測(cè)定，采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)手段進(jìn)行種類鑒定，以及對(duì)其菌絲生長(zhǎng)的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在為研究木麻黃莖腐病的發(fā)病規(guī)律及診斷等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料于2018?10?06，從海南省萬(wàn)寧市東澳神州半島近海邊發(fā)病的木麻黃活立木的莖基部采集新鮮靈芝樣本，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織分離并風(fēng)干保存；供試植物為海南大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地內(nèi)種植3～4 年生的木麻黃苗木。

1.2 培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)；檳榔（Areca catechuLinn.）、木麻黃（Casuarina equisetifolia）、印度紫檀（Pterocarpus indicus）、橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）、耳葉相思（Acacia auriculiformis）、銀合歡（Leucaena leucocephala）6 種樹(shù)木的新鮮葉柄或枝條浸汁培養(yǎng)基，采用文獻(xiàn)[7 ? 8]的方法進(jìn)行配制；木屑培養(yǎng)基的配制參考文獻(xiàn)[9]的方法。

1.3 試劑及儀器DNA 提取試劑盒OMEGA Fungal DNA Kit 購(gòu)自美國(guó)OMEGA 公司，2×Taqplus PCR Master Mix 購(gòu)自Biosharp 公司，D2000DNA Ladder 購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。攝影生物顯微鏡為日本Olympus BX-51。

1.4 菌株的分離純化采用常規(guī)的擔(dān)子果組織分離法，參照文獻(xiàn)[6]中的高等擔(dān)子菌分離，對(duì)分離得到的菌落進(jìn)行多次純化，獲得10 株形態(tài)相同的菌株，選取其中長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良的3 株菌株進(jìn)行rDNA-ITS 檢測(cè)，測(cè)序結(jié)果一致后，從中選取具有代表性的菌株（編號(hào)為MMHJF001），放置于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫黑暗條件下保存，備用。

1.5 接種體制備從MMHJF001 菌落邊緣打取邊長(zhǎng)約1 cm×1 cm 的菌絲塊接種到滅菌后的袋裝木屑培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)約30 d，待菌絲布滿袋裝培養(yǎng)基后備用。

1.6 致病性測(cè)定參考文獻(xiàn)[9]的方法，略作改動(dòng)。用70%的乙醇對(duì)3～4 年生的木麻黃幼樹(shù)基部莖干表面進(jìn)行消毒，再用滅過(guò)菌的手術(shù)刀在待接種木麻黃樹(shù)莖干部位削去1 層表皮產(chǎn)生輕微創(chuàng)傷，將長(zhǎng)滿MMHJF001 菌絲的接種體緊貼在傷口處，并用濕棉花進(jìn)行保濕，然后用保鮮膜將接種體捆綁固定。設(shè)置8 個(gè)重復(fù)，用同樣的方法將空白接種體接種3 株對(duì)照木麻黃樹(shù)。接種后定期觀察并淋水，拍照記錄。

1.7 擔(dān)子果誘導(dǎo)打取MMHJF001 菌落的菌絲塊放置于瓶裝木屑培養(yǎng)基（已滅菌）中，進(jìn)行擔(dān)子果誘導(dǎo)。放置于室內(nèi)弱光條件下常溫保濕培養(yǎng)，定期觀察。

1.8 病原菌的鑒定依據(jù)《中國(guó)真菌志：第十八卷靈芝科》[10]《中國(guó)大型真菌》[11]等資料對(duì)病原菌的擔(dān)子果進(jìn)行表觀形態(tài)鑒定，用攝影生物顯微鏡對(duì)病原菌的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察、測(cè)量和拍照。將MMHJF001 菌株培養(yǎng)5 d 后，使用OMEGA Fungal DNA Kit 提取其總DNA。采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3′)/ ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增rDNA 基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和通用引物NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)/NS4(5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′)擴(kuò)增核糖體小亞基序列[12]。擴(kuò)增產(chǎn)物純化、回收后，送生工公司進(jìn)行序列測(cè)定。將所獲的序列在NCBI 進(jìn)行Blast 比對(duì)，并提交序列。使用Sequence Matrix 軟件進(jìn)行序列拼接，使用MEGA6.0 軟件以最大似然法（Maximum Likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[13]。

1.9 MMHJF001 菌株生物學(xué)特性測(cè)定用直徑5 mm 的滅菌打孔器從培養(yǎng)5 d 的MMHJF001 菌株菌落邊緣打下菌絲塊，分別將菌絲塊接種至培養(yǎng)基上，5 d 后采用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。將接種菌絲塊的PDA 培養(yǎng)基，分別置于15、18、20、23、25、28、30、33、35、37、40 ℃共11 個(gè)不同溫度條件下進(jìn)行恒溫暗培養(yǎng)。用1 mol·L?1的HCL 和1 mol·L?1的NaOH 將PDA 培養(yǎng)基的pH 分別調(diào)至2、3、4、5、6、7、8、9、10 共9 個(gè)梯度，制成平板后接入菌株菌絲塊，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)。將菌絲塊移接至PDA 平板上，分別在連續(xù)光照、完全黑暗和12 h 光暗交替3 種不同條件下培養(yǎng)（28 ℃）。

將菌株菌絲塊分別移接于供試的6 種樹(shù)木浸汁培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。

1.10 數(shù)據(jù)處理利用SAS 8.1 軟件和Excel 2019 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s multiple range test 進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木麻黃田間發(fā)病癥狀木麻黃樹(shù)被病原菌侵染后表現(xiàn)為樹(shù)冠稀疏，嫩枝失綠，枯枝多（圖1A），后期整株變黃枯死（圖1B，圖1C）。在發(fā)病樹(shù)木的莖干基部木質(zhì)部組織出現(xiàn)白色腐朽（圖1D）。多雨季節(jié)，病株莖基部長(zhǎng)出褐色檐狀的新鮮靈芝擔(dān)子果（圖1E，圖1F）。

2.2 致病性測(cè)定接種3 個(gè)月后觀察MMHJF001 菌株對(duì)木麻黃樹(shù)基部的侵染的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幼樹(shù)樹(shù)冠稀疏，生長(zhǎng)不良，枯枝多，重病株整株枯死（圖2A），莖干接種部位長(zhǎng)滿白色菌絲，莖干內(nèi)部組織白腐（圖2B，圖2C），與田間病害癥狀相同。對(duì)照幼樹(shù)則生長(zhǎng)正常，創(chuàng)傷部位邊緣已長(zhǎng)出愈傷組織，內(nèi)部組織健康（圖2D）。采集發(fā)病組織進(jìn)行再分離獲得的菌株與MMHJF001 相同。表明分離菌MMHJF001 為致病菌。將菌株接種到瓶裝木屑培養(yǎng)基，6 個(gè)月后長(zhǎng)出的擔(dān)子果與發(fā)病樹(shù)木莖基部生長(zhǎng)的擔(dān)子果形態(tài)特征相同（圖2E）。

圖1 木麻黃的田間發(fā)病癥狀A(yù)：病株樹(shù)冠稀疏：B，C：病樹(shù)整株枯死：D：病樹(shù)莖干木質(zhì)部組織白腐；E，F(xiàn)：病樹(shù)莖基部生長(zhǎng)的擔(dān)子果。Fig.1 Field symptoms of diseased Casuarina equisetifoliaA: Sparse crown of the infected tree; B and C: The trees died of infection; D: White rot of stem xylem tissue of the infected tree; E and F: Basidiocarps on the stem base of the infected tree.

圖2 菌株的致病性測(cè)定A：接種5 個(gè)月后的木麻黃整株枯死；B、C：病原菌已在接種部位定殖，內(nèi)部組織白腐；D：對(duì)照；E：接種分離菌的瓶裝木屑培養(yǎng)基誘導(dǎo)長(zhǎng)出的擔(dān)子果。Fig.2 Pathogenicity test of Ganoderma australe (Fr.) PatA: The whole plant died after 5 months of inoculation; B and C: Pathogens have colonized at the inoculation site, and white rot appeared on the internal tissue; D: Healthy plant; E: Isolated strains were developed into basidiocarps in bottled sawdust medium.

2.3 病原菌鑒定形態(tài)鑒定 (1)菌落特征：在PDA 平板上培養(yǎng)的MMHJF001 的菌落前期為白色，邊緣圓形或扇形，菌絲邊緣稀薄，中間較濃密，菌落老化后變淡黃色（圖3A）。(2)擔(dān)子果：擔(dān)子果一年生至多年生，無(wú)柄，硬木栓質(zhì)，單生、群生或疊生。菌蓋呈半圓形，大小為（8.0～21.8） cm×（5.8～12.5） cm，厚約4 cm，有明顯同心環(huán)紋和環(huán)棱，菌蓋邊緣較鈍；擔(dān)子果上表面顏色呈灰褐色、土褐色或黑褐色，無(wú)漆樣光澤，邊緣較鈍，白色，下表面灰白色。陰暗條件下生長(zhǎng)的擔(dān)子果顏色較深，強(qiáng)光下生長(zhǎng)的擔(dān)子果顏色稍淺。菌肉呈棕色或肉桂色，厚1.5～2.1 cm，菌管褐色或深褐色，長(zhǎng)0.5～0.7 cm（圖3B～圖3E）。(3)顯微結(jié)構(gòu)：剛彈射出不久的新鮮孢子為典型的南瓜子形，雙層壁，褐色或淡褐色，大小為（5.5～6.5） μm ×（8.7～11.1） μm，平均5.9 μm×10.0 μm，大端鈍圓，小端呈圓錐形，其頂端無(wú)色透明，擔(dān)孢子中央有一個(gè)較大的油滴；老熟擔(dān)孢子小端平截，無(wú)色部分消失，大小為（5.8～6.8） μm×（7.4～8.8） μm，平均6.1 μm×8.3 μm，雙層壁明顯，顏色略深（圖3F）。

圖3 病原菌形態(tài)A：PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5 天的菌落（正面）；B：弱光下生長(zhǎng)的擔(dān)子果；C：強(qiáng)光下生長(zhǎng)的擔(dān)子果；D：擔(dān)子果（正面）；E：擔(dān)子果（反面）；F：擔(dān)孢子。Fig.3 Morphology of pathogenA: Colony morphology of 5 days old culture on PDA medium (front side); B: Basidiocarps growing in a low light condition;C: Basidiocarp growing in a strong light condition; D: Basidiocarp (front side); E: Basidiocarp (back side); F: Basidiospores.

分子鑒定：測(cè)序后獲得MMHJF001 菌株的rDNA-ITS 和SSU 序列長(zhǎng)度分別為635 bp(NCBI 登錄號(hào)為MN696209.1)和1 076 bp(登錄號(hào)為MN696211.1)。將序列分別在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，結(jié)果顯示與NCBI 上登陸號(hào)為MN689631.1、LC084663.1、AF0266291.1 等南方靈芝[Ganoderma australe(Fr.) Pat.]的序列相似度達(dá)99%。在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中選取rDNA-ITS，SSU 相關(guān)基因序列（表1），將2 種序列拼接，利用MEGA 6.0 軟件聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明，菌株MMHJF001 與南方靈芝的遺傳距離最小，聚為一類，同源性達(dá)100%（圖4）。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，確定MMHJF001 菌株為南方靈芝[Ganoderma australe(Fr.) Pat.]。

2.4 生物學(xué)特性從圖5 可知，MMHJF001 菌株菌絲在15～37 ℃均能生長(zhǎng)，在15～28 ℃時(shí)隨著溫度的上升菌落直徑增大，在28～37 ℃時(shí)隨著溫度的上升菌落直徑則逐漸減小，40 ℃時(shí)停止生長(zhǎng)，25～30 ℃溫度范圍適宜生長(zhǎng)，28 ℃為菌絲生長(zhǎng)的最適溫度。

從圖6 可知，病原菌MMHJF001 菌株在pH 為3～9 范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，pH3～7 時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率增快，pH7 時(shí)菌落直徑最大，極顯著高于其他處理，表明pH7 最適宜菌絲生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，南方靈芝更適于在弱酸性至中性環(huán)境中生長(zhǎng)。

表1 菌株的序列登錄號(hào)Tab.1 Accession number of sequences of fungal strains in GeneBank

圖4 基于rDNA-ITS 及SSU 序列基礎(chǔ)的菌株MMHJF001 與其他靈芝屬相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic trees of the strain MMHJF001 based on rDNA-ITS and SSU sequences and other related species of Ganoderma

圖5 不同溫度培養(yǎng)MMHJF001 菌株的菌落直徑小寫字母代表在P<0.05 水平差異顯著，大寫字母代表在P<0.01 水平差異極顯著，下同。Fig.5 Colony diameter of the strain MMHJF001 cultured at different temperaturesLowercase letters represent significant differences at the P<0.05 level; uppercase letters represent highly significant differences at the P<0.01 level, similarly hereinafter.

從圖7 可知，3 種不同光照和黑暗條件MMHJF001 菌株菌絲的生長(zhǎng)差異顯著。在黑暗的條件下菌株菌落直徑最大，菌落邊緣呈圓形，菌絲生長(zhǎng)均勻。在連續(xù)光照條件下的菌落直徑最小，菌落外圍呈不規(guī)則扇形，菌絲生長(zhǎng)不均勻。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黑暗條件有利于病原菌的菌絲生長(zhǎng)。

從表2 可知，原菌MMHJF001 菌株在供試的6 種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。在橡膠樹(shù)、耳葉相思和銀合歡枝條浸出液培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較好，木麻黃、紫檀次之，而在檳榔葉柄浸汁培養(yǎng)基上病原菌長(zhǎng)勢(shì)較差，菌絲較稀薄。本研究結(jié)果表明，銀合歡浸汁培養(yǎng)基最適合木麻黃靈芝莖腐病病原菌的生長(zhǎng)。

圖6 不同 pH 條件下MMHJF001 菌株的菌落直徑Fig.6 Colony diameter of the strain MMHJF001 cultured at different pH values

圖7 不同光照下MMHJF001 菌株的菌落直徑Fig.7 Colony diameter of the strain MMHJF001 cultured under different light conditions

表2 不同植物浸出液培養(yǎng)基對(duì)MMHJF001 菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effect of different culture mediums on the mycelium growth of the strain MMHJF001

3 討 論

靈芝屬(Ganoderma)擔(dān)子菌主要分布在東亞暖溫帶、亞熱帶炎熱與潮濕的環(huán)境中。目前被世界公認(rèn)的靈芝屬有224 個(gè)種[14]。靈芝屬真菌均是木腐菌，其中，某些種被作為重要的藥用真菌，另一些種則可寄生活立木，引起樹(shù)木的根腐病或莖腐病，其發(fā)生嚴(yán)重時(shí)造成樹(shù)木枯死，是一類重要的病原菌。南方靈芝是一種多寄主的病原木腐菌，可侵染多種熱區(qū)林木，使樹(shù)木基部組織白色腐朽，嚴(yán)重時(shí)樹(shù)木死亡，其主要分布在華中、華東和華南地區(qū)的天然林和人工林內(nèi)[15]。南方靈芝在海南各市縣比較常見(jiàn)，是海南主要的野生靈芝資源之一。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)南方靈芝的研究報(bào)道主要集中在子實(shí)體化學(xué)成分、生物降解和基因組等方面[16?18]，南方靈芝子實(shí)體的化學(xué)成分主要為三萜和甾醇，具有很好的藥用和保健價(jià)值，在生物降解方面具有減少?gòu)U水中酚類物質(zhì)的能力。尚未見(jiàn)南方靈芝引起木麻黃莖腐病的報(bào)道。本研究從海南省萬(wàn)寧市木麻黃上發(fā)現(xiàn)的木麻黃靈芝莖腐病，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定該莖腐病病原菌為南方靈芝（Ganoderma australe(Fr.) Pat.）。本研究結(jié)果表明，該病原菌適宜生長(zhǎng)的溫度范圍為25～30 ℃，最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，最適pH 為7。這與LUANGHARN 等[19]研究中靈芝菌絲體生長(zhǎng)的最佳條件（pH 值為7～8，溫度為25～30 °C）結(jié)果一致。光照對(duì)其菌絲生長(zhǎng)有抑制作用；南方靈芝適宜在橡膠樹(shù)、銀合歡、耳葉相思枝條浸汁培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

筆者在對(duì)海南不同市縣田間調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，橡膠樹(shù)、椰子、油棕、檳榔、銀合歡和耳葉相思等植物上均有由南方靈芝侵染引起的莖腐病。在?？?、澄邁、萬(wàn)寧、昌江沿海和沿江的木麻黃防護(hù)林中發(fā)現(xiàn)，樹(shù)齡越大的木麻黃林發(fā)病率越高，風(fēng)斷樹(shù)多的林地發(fā)病重。其原因主要是此類林地臨近水域，林間濕度大有利于南方靈芝子實(shí)體的形成和擔(dān)孢子產(chǎn)生，強(qiáng)臺(tái)風(fēng)及造成的傷口則較有利于南方靈芝擔(dān)孢子的傳播和侵染。

目前，由靈芝科擔(dān)子菌引起的木麻黃莖腐病和根腐病的研究有不少報(bào)道，吳如慧等[6]發(fā)現(xiàn)，木麻黃二孢假芝（Amauroderma subresinosum）可引起木麻黃莖腐病，陳禮浪等[3]的研究結(jié)果表明，熱帶靈芝（Ganoderma tropicum）能引起木麻黃紅根病等。與本研究發(fā)現(xiàn)的南方靈芝引起的木麻黃莖腐病進(jìn)行比較，南方靈芝擔(dān)子果無(wú)似漆樣光澤，顏色呈灰褐色或黑褐色，菌肉呈棕色或肉桂色，而二孢假芝和熱帶靈芝擔(dān)子果均稍有似漆樣光澤，熱帶靈芝新鮮擔(dān)子果表面顏色紅褐色或黃褐色，菌肉褐色，二孢假芝新鮮擔(dān)子果表面紅褐色，成熟后表面呈黑褐色，菌肉淺黃色或污白色。除擔(dān)子果形態(tài)不同以外，南方靈芝和二孢假芝引起病樹(shù)莖基部組織白腐，而熱帶靈芝則引起木麻黃紅根病，樹(shù)根表面平粘一層泥沙，病根表面可見(jiàn)棗紅色或黑紅色革質(zhì)菌膜。筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，靈芝科中多種真菌均可引起木麻黃等林木的莖腐病或根腐病。不同病原種類的靈芝菌引起的木麻黃莖腐病還有待進(jìn)一步深入研究，以便為準(zhǔn)確診斷和防治此類病害提供參考。