扶艷萍，漆艷香，謝藝賢，彭 軍，曾凡云，張 欣

（1.華中農(nóng)業(yè)大學 植物科學技術(shù)學院，武漢 430070; 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 環(huán)境與植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室，?？?571101）

香蕉（Musaspp.）是我國南亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟作物。香蕉灰紋?。ㄓ址Q香蕉暗雙孢霉葉斑?。┮殉蔀槲覈憬懂a(chǎn)區(qū)常見且危害嚴重的病害之一，嚴重威脅著香蕉產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展[1?6]。該病主要危害葉片，且常和Sigatoka 葉斑病混合發(fā)生，造成多種病原的復(fù)合侵染[7?9]。目前國外已報道的引起香蕉灰紋病的病原真菌有Neocordana musae（Cordana musae）、N.johnstonii（C.johnstonii）、N.musicola、N.musarum、N.musigena及N.malayensis等[10?15]，國內(nèi)已報道的有C.musae[4,16?18]，但國內(nèi)相關(guān)報道只是進行形態(tài)與培養(yǎng)性狀觀察，未進行分子生物學的進一步驗證。為了進一步明確海南香蕉灰紋病病原菌的種類及其生物學特性，本研究從海南香蕉主產(chǎn)區(qū)采集多份病葉進行組織分離純化和致病性測定，采用傳統(tǒng)形態(tài)學特征觀察、rDNA-ITS 測序及其系統(tǒng)發(fā)育樹分析等方法對該病害病原進行鑒定，并在此基礎(chǔ)上測定了該菌在不同培養(yǎng)基、溫度、pH、碳源、氮源、光照、通氣等條件下的生物學特性，以期為深入研究海南香蕉灰紋病的發(fā)生流行及防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與培養(yǎng)從海南香蕉產(chǎn)區(qū)采集典型灰紋病癥狀的香蕉葉片，用無菌水沖洗干凈并晾干，采用組織分離法[19]進行病原菌分離。在病健交界處取3～5 mm 的組織塊，先用0.1 %升汞消毒1 min，再用75 %乙醇漂洗30 s 后，用無菌水漂洗3 次，再用濾紙吸干水分，移至PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待菌落長出后，挑取菌落邊緣菌絲塊，置于PDA 平板上進一步純化培養(yǎng)。分離純化后的菌種轉(zhuǎn)移到PDA 斜面培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 致病性測定選用PDA 平板上培養(yǎng)7 d 的菌絲塊對健康香蕉植株葉片進行刺傷接種。挑選生長良好、生育期相近、植株大小比較一致的巴西蕉植株6 株，先用清水沖洗巴西蕉葉片，再用無菌水清洗巴西蕉葉片，后用75%酒精沖洗滅菌進行表面消毒，無菌水沖洗3 次，晾干后備用。每株選取1 片葉片，用滅菌針在葉脈左右相對位置進行刺傷，取直徑6 mm 菌絲塊接種于經(jīng)滅菌針刺傷的葉片（菌絲面緊貼葉片傷口處），每片葉接種2 塊菌絲塊，以未接菌PDA 瓊脂塊為對照，每個處理3 次重復(fù)。用脫脂棉覆蓋菌絲塊，期間噴無菌水保濕48 h，3 d 后移去菌絲塊，觀察葉片發(fā)病情況。待接種葉片發(fā)病后，根據(jù)柯赫氏法則，從病斑處分離病原菌，并觀察與原接種病原菌形態(tài)特征是否一致。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學鑒定將分離純化得到的病原菌轉(zhuǎn)接至PDA 平板上，于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)7 d，期間觀察并記錄菌落顏色、形態(tài)、氣生菌絲疏密程度等形態(tài)特征。在顯微鏡下觀察病原菌的分生孢子和分生孢子梗形態(tài)。

1.3.2 分子生物學鑒定將供試菌株接種到PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，用載玻片刮取培養(yǎng)基表面的菌絲備用。采用CTAB 法[20]提取菌株基因組DNA，用真菌核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS1 與ITS4[21]對其rDNA-ITS 區(qū)進行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行測序。利用EMBL 數(shù)據(jù)庫中Clustal Omega 程序、GenBank 數(shù)據(jù)庫中的Blastn 程序和MEGA 6 軟件進行各序列間的同源性和進化距離的分析與比較，并構(gòu)建NJ 系統(tǒng)進化樹。

1.4 病原菌生物學特性測定

1.4.1 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基（OA）、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（CA）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）、查氏培養(yǎng)基（CDA）及香蕉葉片煎汁瓊脂培養(yǎng)基（LEDA）。將病原菌接種于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，用滅菌的6 mm 打孔器在菌落邊緣上打取菌絲塊，接種至各種培養(yǎng)基平板上。各處理重復(fù)5 皿，在28 ℃下培養(yǎng)，并采用十字交叉法每隔2 d 測量菌落直徑，按菌絲生長速率=菌落平均直徑（cm）/培養(yǎng)時間（d），計算菌絲在各供試培養(yǎng)基上3、5、7、9 d 的生長速率（cm·d?1）和滿皿時間（d）。

1.4.2 溫度對菌絲生長的影響將接有6 mm 病原菌菌絲塊的PDA 平板分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃恒溫培養(yǎng)，各處理重復(fù)5 皿，7 d 后觀察菌落生長情況，十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.3 pH 對菌絲生長的影響用磷酸緩沖液（0.2 mol·L?1磷酸二氫鈉、0.2 mol·L?1磷酸氫二鈉）配制PDA 培養(yǎng)基，再用1 mol·L?1磷酸、1 mol·L?1NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至4、5、6、7、8、9、10(7 個梯度)。將6 mm病原菌菌絲塊分別轉(zhuǎn)接不同pH 的PDA 平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，各處理重復(fù)5 皿，7 d 后觀察菌落生長情況，十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.4 碳源對菌絲生長的影響將6 mm 病原菌菌絲塊轉(zhuǎn)接至含有不同碳源的查氏培養(yǎng)基上。碳源分別是葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、淀粉和果糖，以不加碳源為對照，各處理重復(fù)5 皿，28 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d 后觀察菌落生長情況，十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.5 氮源對菌絲生長的影響將6 mm 病原菌菌絲塊轉(zhuǎn)接至含有不同氮源的查氏培養(yǎng)基上。氮源分別為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、脲、磷酸氫二銨、硝酸鈉、氯化銨和硫酸銨，以不加氮源為對照，各處理重復(fù)5 皿，28 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d 后觀察菌落生長情況，十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.6 光照對菌絲生長的影響將接有6 mm 病原菌菌絲塊的PDA 平板分別置于24 h 全光照、24 h 全黑暗、12 h 光照12 h 黑暗、16 h 光照8 h 黑暗（長日照）、16 h 黑暗8 h 光照（短日照）5 種光照處理下，各處理重復(fù)5 皿，28 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d 后觀察菌落生長情況，十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.7 通氣條件對菌絲生長的影響將6 mm 病原菌菌絲塊置于盛有100 mL PD 液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，每瓶裝3 個菌絲塊，設(shè)3 種培養(yǎng)方式：28 ℃恒溫靜置、28 ℃恒溫搖床振蕩以及28 ℃恒溫振蕩12 h 靜置12 h，其中搖床振蕩轉(zhuǎn)速梯度分別設(shè)置為50、100、150、200 r·min?1，各處理重復(fù)3 瓶，7 d 后稱取菌絲的干、濕質(zhì)量。

1.4.8 致死溫度病原菌在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 后，加入40 mL 無菌水，用滅菌三角棒刮取病原菌菌絲，制成菌懸液；分別取5 mL 至各滅菌試管中，分別置于室溫（27.2 ℃），40，45，50，55，60，65，70 ℃的水浴中，分別水浴5，10，15，20 min，共32 個處理，期間緩緩搖動試管，以保證溫度均勻。水浴后立即取出用冷水降溫，取0.5 mL 菌懸液涂于PDA 培養(yǎng)基上，各處理重復(fù)5 皿，28 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d 后觀察生長情況。

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并用Duncan 法比較均值間的差異顯著性，以上所有統(tǒng)計過程均用Excel 2019 和Spss 軟件26.0.0.0 完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離與致病性測定采用組織分離法從發(fā)病香蕉葉片分離獲得6 株純化的真菌菌株，菌落形態(tài)觀察及鏡檢表明，6 株分離菌形態(tài)特征一致，為同一種真菌。接種后第3 d，葉片刺傷處（6 個菌絲塊接種點）均開始發(fā)病，發(fā)病率為100%，而PDA 瓊脂塊接種的對照葉片均未發(fā)病。菌絲塊接種點病斑為短橢圓形，隨葉脈方向擴展，外圍具黃色暈圈，中間灰褐色，有輪紋，其發(fā)病癥狀（圖1A）與田間發(fā)病癥狀相似（圖1B）。根據(jù)柯赫氏法則，從接種發(fā)病的香蕉葉片上重新分離到與原接種菌株形態(tài)特征一致的真菌，確認6 株分離菌株為香蕉灰紋病的致病菌。

2.2 病原菌鑒定病原菌在PDA 培養(yǎng)基上的菌落正面呈圓形，灰白色，絨毛狀，邊緣不整齊，有輪紋；基底中菌絲灰褐色至灰黑色，質(zhì)地緊密，生長旺盛（圖1C）；菌落背面呈黑褐色，同心輪紋狀，邊緣明顯，有淡黃色暈圈（圖1D）。經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，分生孢子梗褐色、直立、無分枝；分生孢子梗頂端突出膨大，產(chǎn)孢（圖1E）；分生孢子雙胞、倒卵形，隔膜處有縊縮，透明或微褐色，孢子頂端具臍點（圖1F）。根據(jù)病原菌的培養(yǎng)性狀與形態(tài)學特征，參考HERNáNDEZ-RESTREPO 等[12]、戚佩坤[16]及PLOETZ 等[22]的描述，將海南的香蕉灰紋病病原初步鑒定為暗雙孢屬真菌（Neocordanasp.）。

圖1 香蕉灰紋病癥狀及其病原菌形態(tài)特征A：香蕉灰紋病回接發(fā)病癥狀；B：香蕉灰紋病田間發(fā)病癥狀；C：菌落正面；D：菌落反面；E：分生孢子梗；F：分生孢子。Fig.1 Symptoms of Cordana leaf spot and its pathogen morphologyA: Symptoms of Cordana leaf spot on inoculated leaves; B: Symptoms of Cordana leaf spot on leaves in the field; C: Front of colony; D: Back of colony; E: Conidiophore; F: Conidia.

提取6 株病原菌的基因組DNA，利用rDNA-ITS 通用引物對ITS1/ITS4 進行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)測序及序列多重比對，發(fā)現(xiàn)6 株病原菌的rDNA-ITS 區(qū)擴增片段長度均為575 bp，且相似性為100%。選擇1 號菌株的ITS 序列提交到GenBank（登錄號：MN960387），并命名為CATAS-CM01。經(jīng)GenBank 數(shù)據(jù)庫Blantn 比對分析，CATAS-CM01 與GenBank 中公布的Neocordana musae（LN713276-LN713278，LN713280-LN713282，KP770138）相應(yīng)片段最相近，相似性達99.28%～99.65%，與N.malayensis（MK442593）、N.musarum（KY173424-KY173425）、N.musigena（KY979749-KY979750）及N.musicola（LN713283-LN713285）相應(yīng)片段序列相似性為95.6%～98.58%，而與其他屬菌株同源性較低，約87%的相似性。以Magnaporthe grisea（登錄號：MH864859、FN555111）、Pyricularia pennisetigena（登錄號：MN889450、MH412638）、Pyricularia angulata（登錄號：MT071757、JF719830）作為外群構(gòu)建菌株CATAS-CM01 的rDNA-ITS 基因系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示CATAS-CM01 與香蕉暗雙孢菌云南分離株XJ13-12-01（登錄號：KP770138）及6 株N.musae模式菌株CPC 19605、CPC 16362、CPC 17293、CPC 17237、CPC 16298 和CPC 18127（登錄號：N713276-LN713278，LN713280-LN713282）以81%的置信度聚在同一分支，遺傳距離最近（圖2）。結(jié)合6 株病原菌的形態(tài)學特征，最終將病原菌鑒定為香蕉暗雙孢菌Neocordanamusae（Cordana musae）[12]。

圖2 菌株CATAS-CM01 基于rDNA-ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of pathogenic fungus CATAS-CM01 based on rDNA-ITS sequences

2.3 病原菌生物學特性測定

2.3.1 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響病原菌在7 種培養(yǎng)基上均能生長，其中生長最快的是LEDA 和CMA 培養(yǎng)基，平均生長速率分別為0.56 cm·d?1和0.55 cm·d?1，滿皿時間分別為18 d 和19 d，菌落邊緣規(guī)則，但氣生菌絲輕??；其次是OA 培養(yǎng)基和PDA 培養(yǎng)基，平均生長速率均為0.49 cm·d?1，滿皿時間為21 d，菌落邊緣雖不規(guī)則，但氣生菌絲較緊密，PDA 培養(yǎng)基上的菌落有輪紋；生長較慢的培養(yǎng)基依次為PSA、CA 和CDA，平均生長速率分別為0.44、0.39、0.35 cm·d?1，滿皿時間分別為23、26、29 d（表1）。OA、PDA、LEDA 及CMA 培養(yǎng)基上的菌落平均生長速率無顯著差異（P<0.05），結(jié)合菌落形態(tài)及滿皿時間，最適合菌落生長的培養(yǎng)基為OA 和PDA。病原菌菌絲的生長速率隨天數(shù)的增加而逐漸減慢，在7 d 時各培養(yǎng)基上菌絲的生長速率逐漸趨于穩(wěn)定（圖3）。

表1 不同培養(yǎng)基對暗雙孢菌菌絲生長的影響Tab.1 Effect of different culture mediums on mycelial growth of N.musae

圖3 暗雙孢菌菌絲在不同培養(yǎng)基上的生長速率Fig.3 Effect of different culture media on the growth rate of N.musae

2.3.2 溫度對菌絲生長的影響病原菌在10～40 ℃范圍內(nèi)均能生長，適宜生長溫度為25～30 ℃，與其他處理溫度有顯著差異（P<0.05），且最適生長溫度為30 ℃。溫度≤15 ℃或者≥35 ℃時，病原菌生長受抑制（圖4）。

2.3.3 pH 對菌絲生長的影響病原菌在pH 4～10 范圍內(nèi)均可生長，pH 5～7 時生長較好，pH 為6 時生長最佳，與pH 7 差異不顯著，但與其他pH 有顯著差異（P<0.05）。pH 大于8 時，菌絲擴展受抑制（圖5）。

2.3.4 碳源對菌絲生長的影響病原菌在不同碳源的培養(yǎng)基上均可生長，其中對乳糖利用效果最好，與其他碳源有顯著差異（P<0.05），其次是蔗糖和淀粉，果糖利用效果最差（圖6）。

圖4 不同溫度對暗雙孢菌菌絲生長的影響Fig.4 Effect of different temperatures on mycelial growth ofN.musae

圖5 不同pH 對暗雙孢菌菌絲生長的影響Fig.5 Effect of different pHs on mycelial growth of N.musae

2.3.5 氮源對菌絲生長的影響病原菌在不同氮源的培養(yǎng)基上均能生長，其中對蛋白胨、酵母膏及硝酸鈉利用較好，與其他氮源有顯著差異（P<0.05），且以酵母膏最佳，其次是脲、磷酸氫二銨和牛肉膏，氯化鈉和硫酸銨的利用最差（圖7）。

圖6 不同碳源對暗雙孢菌菌絲生長的影響Fig.6 Effect of different carbon sources on mycelial growth of N.musae

2.3.6 光照對菌絲生長的影響病原菌在5 種光照條件下均能生長，其中24 h 全光照條件下菌落直徑最大，為4.06±0.14 a（a、b、c、d 表示差異顯著性，下同）；其次是16 h 光照8 h 黑暗（長日照）和12 h光照12 h 黑暗，菌落直徑分別為3.80±0.05 ab，3.39±0.03 c；在24 h 全黑暗條件下菌落直徑最小，為2.96±0.09 d；8 h 光照16 h 黑暗（短日照）條件下菌落直徑為3.53±0.08 bc。全黑暗與全光照及光暗交替培養(yǎng)有顯著差異，說明光照利于菌絲生長。

2.3.7 通氣條件對菌絲生長的影響通氣與不通氣對菌絲生長均有一定影響，在4 種轉(zhuǎn)速梯度中，均以24 h 振蕩培養(yǎng)的菌絲濕質(zhì)量、干質(zhì)量最大，與其他處理差異最顯著（P<0.05），其中以轉(zhuǎn)速200 r·min?1時，菌絲濕質(zhì)量、干質(zhì)量分別達4.50 g 和2.91 g；其次是12 h 振蕩12 h 靜置；24 h 靜置處理條件下，菌絲濕質(zhì)量、干質(zhì)量最低（表2）。

2.3.8 致死溫度測定病原菌菌絲在60 ℃下水浴10 min 后仍能在PDA 平板上正常生長，但在60 ℃及以上溫度處理15 min 后不能生長，說明病原菌菌絲的致死溫度為60 ℃ 10 min（表3）。

圖7 不同氮源對暗雙孢菌菌絲生長的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on mycelial growth of N.musae

表2 通氣條件對暗雙胞菌菌絲生長的影響Tab.2 Effect of ventilation condition on mycelial growth of N.musae

表3 暗雙胞菌菌絲的生長致死溫度Tab.3 The lethal temperature on mycelial growth of N.musae

3 討 論

香蕉灰紋病是香蕉生長過程中重要的葉部病害之一，病害流行時可導(dǎo)致香蕉減產(chǎn)30%～50%[5]，引起香蕉灰紋病的病原有6 種[10?15]。Hernández-Restrepo 等[12]依據(jù)形態(tài)學特征和LSU 及ITS 序列分析等相關(guān)數(shù)據(jù)，提出將香蕉灰紋病病原C.musae[10]、C.johnstonii[11]、C.musicola及其相關(guān)種從Cordana屬中分出來，歸入新屬Neocordana。此命名代表了該菌的最新分類進展，已得到部分研究者的承認[13?15]，但目前也有部分國內(nèi)外研究者仍用Cordana屬描述香蕉灰紋病病原菌[6,23?24]。

傳統(tǒng)真菌病害的鑒定主要是根據(jù)病害癥狀特征、病原真菌的形態(tài)學及生物學等特性進行，但有些植物病原真菌在不同培養(yǎng)條件下形態(tài)變異較大，給真菌的分類鑒定帶來了一定的難度。真菌DNA 的堿基組成遺傳穩(wěn)定，不易受環(huán)境影響，而且在其生活史的任何階段均可獲得，其中rDNA 的ITS 區(qū)段既具保守性，又在科、屬、種水平上均有特異性序列的特性，對ITS 區(qū)序列進行PCR 擴增、測序以及序列分析是鑒定真菌的常用方法。RENSKE 等[25]認為，通過比對真菌ITS 區(qū)，序列相似性大于99%時，可鑒別為相同種；序列相似性大于95%且小于99%時，可鑒別為相同屬；序列相似性小于95%時，可鑒別為相同科。本研究對分離菌株的ITS 序列進行比對分析并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，依據(jù)Renske 等[25]研究結(jié)論結(jié)合分離菌株的培養(yǎng)性狀、形態(tài)學特征及其柯赫氏法則驗證，將海南香蕉灰紋病的病原鑒定為香蕉暗雙孢菌Neocordana musae。

為了便于病害的預(yù)測預(yù)報及科學防治，筆者進一步研究了該病原菌的生物學特性，確認該病原菌最適培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基和OA 培養(yǎng)基，最適生長溫度為30 ℃，最適生長pH 為6，可利用多種碳源、氮源，光照、通氣利于菌絲生長，致死條件為60 ℃ 10 min。這與該病原菌適應(yīng)環(huán)境能力較強的研究結(jié)論基本一致[18,23]。

另外，本實驗供試菌株在40 ℃也能正常生長，致死條件為60 ℃ 10 min，與番華彩等[18]對在云南分離的香蕉暗雙孢菌生物學特性的研究結(jié)果存在差異；進一步的系統(tǒng)進化樹分析也發(fā)現(xiàn)，代表菌株CATAS-CM01 與來自墨西哥培養(yǎng)型模式菌株（CPC 16362、CPC 16298）、澳大利亞培養(yǎng)型模式菌株（CPC 17237、CPC 17293）遺傳距離較近，處于同一小分支，而與國內(nèi)云南分離株（XJ13-12-01）遺傳距離較遠。以上研究表明，香蕉灰紋病菌的生物學特性隨地域的不同有一定差異，這可能是該病原菌在不同區(qū)域具有不同的生態(tài)適應(yīng)性，具體原因還有待進一步研究。本研究僅探討了培養(yǎng)基、溫度、pH、碳氮源、光照及通氣等因素對香蕉暗雙孢菌菌絲生長的影響，因此結(jié)果具有一定的局限性。下一步，本實驗室將開展病原菌孢子產(chǎn)生與萌發(fā)條件及病原菌致病性分化與遺傳變異等方面的觀測與研究，探討香蕉灰紋病菌群體遺傳特征，以期為海南香蕉灰紋病的監(jiān)測預(yù)報和綜合防治提供更多理論依據(jù)。