董 晨，魏永贊，王 弋，鄭雪文，李偉才

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 南亞熱帶作物研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學重點實驗室，廣東 湛江 524091）

單鋅指DNA 結(jié)合蛋白（DNA binding with one finger，Dof）是一類植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，由多基因家族編碼。Dof 蛋白大約由200～400 個氨基酸殘基（Amino acid, aa）組成，Dof 蛋白含有2 個主要的保守結(jié)構(gòu)域：即N 末端具有高度保守DNA 結(jié)合域和位于C 末端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控域[1]。Dof 蛋白N?末端的DNA 結(jié)合域由52 個保守的氨基酸殘基組成的CX2CX21CX2C 單鋅指結(jié)構(gòu)，基序中的4 個Cys 殘基和1 個Zn2+共價結(jié)合，Dof 蛋白的DNA 結(jié)合域與不同植物的啟動子DNA 結(jié)合具有特異性，識別AAAG 或互補序列CTTT 基序作為核心序列元件[2]，但是南瓜Dof 蛋白AOBP 為例外，AOBP 蛋白特異識別AGTA 序列[3]。位于C?末端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列不具有保守性，導致Dof 蛋白在植物生長發(fā)育過程中的功能的多樣性。自從第一個Dof（ZmDof1）基因在玉米中克隆以來[4]，迄今為止從單細胞藻類到高等植物，越來越多的Dof 基因被克隆鑒定或從基因組數(shù)據(jù)庫中被預測出來?；谥参颎ene bank 數(shù)據(jù)庫已被鑒定的Dof 基因家族數(shù)目為擬南芥36 個[5]、水稻30 個[5]、玉米46 個[6]、小麥31 個[7]、大豆28 個[8]、高粱28 個[9]、馬鈴薯35 個[10?11]、番茄34 個[12]、菊花20 個[13]、大白菜76 個[14]、香蕉74 個[15]、榴蓮24 個[16]、木薯45 個[17]、辣椒33 個[18]、葡萄25 個[19]等，但目前關(guān)于荔枝Dof 基因家族的系統(tǒng)分析尚未見報道。本研究利用課題組妃子笑荔枝果肉不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，采用生物信息學方法在轉(zhuǎn)錄組水平上對Dof 基因家族進行系統(tǒng)鑒定，通過對Dof 基因家族基本理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進化和基因表達等進行分析，為進一步了解荔枝Dof 基因家族（LcDof）的功能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料妃子笑荔枝果肉材料取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所荔枝種植園。分別取妃子笑果肉發(fā)育的3 個時期（花后35 ，56，70 d）的樣品，3 個生物學重復，迅速置于液氮中，用于后續(xù)實驗。

1.2 LcDof 鑒定與分析轉(zhuǎn)錄組測序委托廣州基迪奧生物公司，利用Illumina HiSeqTM4000 平臺進行測序，對原始測序數(shù)據(jù)進行過濾、去接頭和低質(zhì)量值數(shù)據(jù)后，用reads 組裝軟件Trinity 軟件進行序列組裝并獲得Unigene 序列，共拼接組裝獲得61 648 個Unigenes。從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫下載Dof 轉(zhuǎn)錄因子序列作為探針，對本地妃子笑荔枝果肉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行搜索，篩選出LcDof 并利用SMART 和Pfam 驗證，刪除不完整的基因。

1.3 LcDof 生物信息學分析分別采用ProtParam、Plant-mPlc Sever、MEME 和SMART 在線軟件對Dof 基因家族的相應(yīng)基本理化性質(zhì)、亞細胞定位、保守基序、基序功能注釋進行生物信息學分析。MEME 參數(shù)設(shè)置：基序最大值設(shè)為15，基序長度范圍為6～100 個氨基酸，其他參數(shù)為默認值。將荔枝、擬南芥和水稻中的Dof 氨基酸序列通過Clustal X 1.83 進行多重序列比對，進一步通過MEGA6.0 鄰接法（neighbor joining，NJ）將比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。進化樹參數(shù)設(shè)置：P-距離（P-distance）模型，成對刪除（pairwise deletion）空位選項，Bootstrap method 取值1 000。

1.4 LcDof 基因家族在不同處理花穗發(fā)育過程中的表達特征分析Dof 基因家族的表達數(shù)據(jù)基于課題組前期構(gòu)建的“妃子笑”果肉發(fā)育RNA-seq 數(shù)據(jù)庫中的表達數(shù)據(jù)的rpkm 值，利用Heml 熱圖軟件將Dof 基因家族的表達數(shù)據(jù)均一化處理后制作熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LcDof 的鑒定以擬南芥和水稻的Dof 基因家族序列為探針，采用本地blast 方法對荔枝果實發(fā)育RNA-seq 數(shù)據(jù)庫進行比對檢索，同時利用Dof 為關(guān)鍵詞在RNA-seq 數(shù)據(jù)庫直接搜索；將得到的數(shù)據(jù)結(jié)果進一步進行整合分析，去除冗余序列，得到20 個Dof 蛋白序列。隨后采用SMART 和Pfam 在線軟件對Dof 蛋白序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析，最終獲得19 個Dof 蛋白序列（表1）。Dof 基因家族成員編號按照Dof 序列在RNA-seq 數(shù)據(jù)庫中的Unigene ID 號出現(xiàn)順序編號（表1）。LcDof 蛋白序列長度范圍為157～497 aa，平均長度為330.68 aa，LcDof18 蛋白序列最短，LcDof15 蛋白序列最長；LcDof 蛋白序列的分子量（MW）為17.70～54.35 kDa，平均分子量為35.95 kDa。LcDof 等電點（pI）在4.49～9.42，19 個Dof 蛋白中有6 個等電點小于7 顯酸性；13 個等電點大于7 顯堿性；LcDof 蛋白平均等電點大于7，表明LcDof 為弱堿性，在堿性的亞細胞環(huán)境中發(fā)揮作用。分析LcDof 家族不穩(wěn)定指數(shù)發(fā)現(xiàn)，LcDof4/9/11/14 蛋白不穩(wěn)定指數(shù)<40，為穩(wěn)定蛋白，其余均為不穩(wěn)定蛋白。分析LcDof 家族脂肪族氨基酸指數(shù)發(fā)現(xiàn)，Dof 家族的脂肪族氨基酸指數(shù)分布在46.2～66.32 范圍，脂肪族氨基酸指數(shù)與蛋白的熱穩(wěn)定性相關(guān)，表明Dof 家族蛋白質(zhì)間的熱穩(wěn)定性存在差異。LcDof 家族蛋白質(zhì)疏水性指數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）均<0，表明LcDof 家族蛋白均為親水性蛋白。亞細胞定位預測結(jié)果表明，LcDof 蛋白均定位于細胞核，這與轉(zhuǎn)錄因子定位于細胞核結(jié)果相符。

2.2 LcDof 蛋白的保守基序為了進一步了解 LcDof 蛋白結(jié)構(gòu)特征，利用MEME 在線軟件分析19 個LcDof 蛋白的保守基序，不同保守結(jié)構(gòu)域在LcDof 的位置如圖1 所示。LcDof 基因家族中含有15 個保守基序，并將得到的15 個保守基序進一步進行功能注釋（表2）的結(jié)果表明：15 個基序中基序1 出現(xiàn)在所有的蛋白質(zhì)中，為N?末端高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域（zinc-finger Dof domain，zf-Dof），基序8、15 為低密度復雜區(qū)，其余的12 個基序沒有對應(yīng)的注釋，功能未知。雖然荔枝Dof 基因家族成員均含有基序1，但是LcDof 基因家族成員之間包含的保守基序數(shù)目及種類存在一定的差異，其中LcDof2、LcDof15 和LcDof16 含有的基序數(shù)目最多，均含有11 個保守基序；LcDof13 含有8 個基序；LcDof3、LcDof6 和LcDof11 均含2 個基序（motif 1 和motif12）；LcDof8、LcDof9 和LcDof17 均含2 個基序（motif 1 和motif14）。LcDof4 僅含有1 個基序。在進化樹中關(guān)系較近的LcDof 成員間有類似的保守基序，如GroupIV 中的LcDof2、LcDof15 和LcDof16。LcDof 中保守結(jié)構(gòu)域組成相似的成員可能具有相近的基因功能。

表1 荔枝Dof 基因家族信息Tab.1 Litchi Dof gene family information

圖1 LcDof 基因家族成員保守基序分析不同顏色方塊代表不同的保守基序Fig.1 Distribution of conserved motifs in the LcDof gene family members Different color squares represent different conservative motifs

表2 LcDof 蛋白保守基序及功能注釋Tab.2 LcDof protein conserved motifs and functional annotations

圖2 LcDof 基因家族成員保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Conserved domain of LcDof gene family members

圖3 荔枝Dof、擬南芥Dof 和水稻Dof 的鄰接法系統(tǒng)發(fā)生樹不同的形狀表示不同的物種，圓形代表來自荔枝的Dof 蛋白（LcDof）；正方形形代表來自水稻的Dof 蛋白（OsDof）；三角形代表來自擬南芥的Dof 蛋白（AtDof）,不同顏色分支代表不同的亞家族。Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of Dof in litchi, Arabidopsis and riceDifferent shapes represent different species.The circle represents the Dof protein from litchi; the square represents the Dof protein from rice; the triangle represents the Dof protein from Arabidopsis thaliana; different color branches represent different subfamilies.

2.3 Dof 蛋白的多重序列比對及其進化關(guān)系通過對荔枝Dof 基因家族19 個家族成員進行多重序列比對，抽取保守結(jié)構(gòu)域進行觀察分析（圖2），發(fā)現(xiàn)19 個LcDof 蛋白結(jié)構(gòu)域高度保守，均包含CX2CX21CX2C 保守基序，構(gòu)成了C2-C2 型單鋅指結(jié)構(gòu)（Zinc-finger）。為進一步了解Dof 基因家族在荔枝中的進化關(guān)系和生物學功能，分別以荔枝19 個Dof（LcDof）、擬南芥中36 個Dof（AtDof）和水稻中的30 個Dof（OsDof）蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹 (圖3)。聚類結(jié)果表明：19 個荔枝Dof 家族成員分別聚為4 個亞家族（Group I-Group IV）個，其中GroupIV 中含有LcDof 基因家族成員數(shù)最多，有7 個LcDof，分別為LcDof2、LcDof4、LcDof9、LcDof13、LcDof15、LcDof16、LcDof18，占基因家族總數(shù)的36.84%。其次為Group I，含有LcDof 基因家族成員數(shù)最多，有6 個LcDof，分別為LcDof1、LcDof3、LcDof7、LcDof11、LcDof12 和LcDof15，占基因家族總數(shù)的31.58%。第三為Group II，含有5 個LcDof 基因家族成員，占基因家族總數(shù)的26.32%，分別為LcDof6、LcDof10、LcDof14、LcDof17、LcDof19。Group III 含有LcDof 基因家族成員最少，僅有1 個LcDof8，占基因家族總數(shù)的5.26%。荔枝Dof 家族成員與擬南芥Dof 家族成員在進化上親緣關(guān)系較近，而與水稻Dof 家族成員關(guān)系較遠，其中AtDof2.1 和LcDof7，AtDof1.4 和LcDof1，AtDof5.4 和LcDof6，AtDof1.2 和LcDof3 為直系同源基因，推測以上荔枝中Dof 與擬南芥的Dof 在生物學功能上相似。LcDof5 和LcDof12，LcDof10 和LcDof19，LcDof4 和LcDof9，LcDof2 和LcDof15 為旁系同源基因，推測荔枝Dof 轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)歷了基因復制事件，有可能存在功能的冗余。

2.4 荔枝Dof 家族基因的表達為研究荔枝Dof 基因家族在荔枝果實不同發(fā)育時期的表達情況，利用妃子笑荔枝（果肉不同發(fā)育時期）的RNA-Seq 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，找到候選的19 個Dof基因?qū)?yīng)轉(zhuǎn)錄本的RPKM 值，然后用Heml 熱圖軟件對LcDofs的RPKM 值取對數(shù)值轉(zhuǎn)換制作聚類熱圖（圖4）。圖4 顯示，在果肉發(fā)育的不同時期均檢測到19 個LcDof基因的表達，但表達豐度不同；其中LcDof7、LcDof9、LcDof12、LcDof15在果肉不同發(fā)育時期表達量均較強，而LcDof3、LcDof10、LcDof16、LcDof17、LcDof19表達量較低。Group Ⅰ中LcDof3、LcDof5、LcDof12表達規(guī)律相似，Group Ⅱ中LcDof6、LcDof10、LcDof17表達規(guī)律相似，Group Ⅳ中LcDo2、LcDof9、LcDof13和LcDof15表達規(guī)律相似，推測以上基因存在相近的基因功能。

圖4 荔枝果肉不同發(fā)育階段Dof 家族基因的表達熱圖Fig.4 Heat map for expression of LcDof genes in the pulp of litchi fruit at different fruit development stages

3 討 論

植物轉(zhuǎn)錄因子以多基因家族的形式存在，在植物生長發(fā)育及其基因表達調(diào)控過程中發(fā)揮重要的作用。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，目前越來越多的物種基因組公布，在組學水平上對基因家族進行鑒定和生物信息學分析，已成為基因組學的研究熱點。Dof 轉(zhuǎn)錄因子作為植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育和調(diào)控基因表達過程中發(fā)揮著重要的作用。目前關(guān)于植物Dof 基因家族在包括模式植物擬南芥和水稻在內(nèi)的多個物種中進行了鑒定和分析[5?19]。本研究參考擬南芥和水稻Dof 家族基因的信息，基于荔枝果實發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學方法，共鑒定了19 個Dof 基因家族成員。通過對LcDof 基因家族中各蛋白的基本理化性質(zhì)、保守基序、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進化、基因表達進行了生物學分析。分析表明，LcDof 轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白，定位于細胞核，這與馬鈴薯[11]、甜瓜[20]中的報道一致。通過系統(tǒng)進化分析，對荔枝Dof 基因家族進行了詳細的分類和命名。多重序列比對后利用Dof 序列全長構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將LcDof 分為4 個不同的亞家族，該結(jié)果與在擬南芥、水稻、馬鈴薯、香蕉等物種上面的研究結(jié)果一致[5,11,15]，擬南芥中Dof 基因家族的37 個成員、水稻的30 個成員、馬鈴薯35 個成員、香蕉中74 個成員分為4 個亞家族。進化樹中聚類在1 個亞家族的Dof 含有的基序數(shù)目大致相似，比如亞家族4 中的LcDof2、LcDof15和LcDof16，含有相同的基序，推測以上3 個Dof 具有相近的生物學功能。進化樹中聚類在1 個亞家族的Dof 在荔枝果實發(fā)育中基因表達規(guī)律大致相似，例如亞家族1 中LcDof3、LcDof5和LcDof12，推測以上3 個Dof 具有相近的基因功能。通過對荔枝Dof 基因家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析可以看出，荔枝Dof 蛋白的N?末端的DNA 結(jié)合域具有高度的保守性，包含典型的保守結(jié)構(gòu)域C2-C2 的C2-C2 型單鋅指結(jié)構(gòu)（Zinc-finger），且C?末端轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域復雜多變，這與前人的研究結(jié)果一致[5]。本研究同時對荔枝果實發(fā)育轉(zhuǎn)錄組中Dof 蛋白的基因表達特征進行了全面的分析，其中進化關(guān)系近的LcDof成員表達規(guī)律相似，這與香蕉中的MaDof的研究結(jié)果類似[15]。