楊 波 劉海霞 牛鐵泉 張鵬飛 梁長梅 趙旗峰 溫鵬飛

(1山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山西 太谷 030801；2山西農(nóng)業(yè)大學信息科學與工程院，山西 太谷 030801；3山西農(nóng)業(yè)大學果樹研究所，山西 太谷 030801)

葡萄(Vitis viniferaL.)是世界上重要的經(jīng)濟作物之一[1]，其果實、葉片富含多酚類物質(zhì)，具有防癌、抗癌的功能。目前，葡萄葉片已被廣泛用于止血、止痛、消炎和止瀉[2]，在歐洲，已被廣泛用于制藥、化妝品、茶和其他食品的生產(chǎn)中[3]。原花青素(proanthocyanidin，PA)作為重要的一種多酚類物質(zhì)，廣泛存在于葡萄果實、種子[4]和葉片[5]中，具有明顯的保健功能，可有效降低患心血管疾病的風險，具有一定的藥理和治療功能[6]。

原花青素的生物合成受到結(jié)構(gòu)基因(如VvDFR、VvANR、VvLAR1、VvLAR2 等)及調(diào)節(jié)基因的調(diào)控。二氫黃酮醇還原酶(dihydroflavonol-4-reductase，DFR)催化二氫黃酮醇形成無色花青素(leucoanthocyanidin)，花色素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)將無色花青素轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄇ嗨?anthocyanidin)，無色花青素和花青系分別經(jīng)隱色花色素還原酶(leucoanthocyanidin reductase，LAR) 和花色素還原酶(anthocyanidin reductase，ANR)催化形成原花青素[7]。其中ANR 作為原花青素合成關(guān)鍵酶，可催化花青素還原形成表兒茶素，在生物合成途徑的下游發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。

病毒誘導基因沉默技術(shù)(virus induces gene silencing，VIGS)是一種快速、經(jīng)濟的反向遺傳技術(shù)[9]。作為植物中廣泛應用的一種瞬時表達技術(shù)，VIGS 是基于植物病毒的特性來觸發(fā)與轉(zhuǎn)錄后基因沉默相關(guān)的防御機制(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，引發(fā)內(nèi)源基因沉默，可通過下調(diào)基因表達和分析產(chǎn)生的表型的方法來研究基因功能[10]。該技術(shù)用于檢測目的基因功能[11]，容易分析出突變分析無法研究的植物生存所需的關(guān)鍵代謝和調(diào)節(jié)基因[12]。VIGS 避開了植物轉(zhuǎn)化，方法簡單[13]，已被研究者廣泛采用，沉默后表現(xiàn)生長遲緩、發(fā)黃和光漂白現(xiàn)象[14]。VIGS 侵染方式及侵染部位多種多樣，可用于研究包括花冠[15]、花瓣[16]、果實[17]、葉片[18]在內(nèi)的多種植物器官的基因功能。VIGS 病毒載體也有很多，在小麥[19]、大麥[20]、燕麥[21]、玉米[22]等單子葉植物上常采用大麥條紋花葉病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)為病毒誘導基因沉默載體，香蕉[23]、草莓[24]等草本植物采用黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)，水稻[25]、狗牙草、結(jié)縷草[26]等草本植物采用水稻東格魯桿狀病毒(Rice tungro bacilliform virus，RTBV)。研究發(fā)現(xiàn)，煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)載體可以克服宿主范圍窄的缺點，是目前使用最廣泛的VIGS 病毒載體[27]，也成為植物中最常用的VIGS 載體[28]，在柑橘[28]、棉花[29]、甜櫻桃[30]、大豆[31]、番茄[32]等雙子葉植物以及灌木牡丹[33]、桑樹[34]等植物中均有報道。在葡萄上，利用農(nóng)桿菌介導微繁殖葡萄可以沉默葡萄試管苗的PDS基因[35]，但利用TRV 介導的VIGS 技術(shù)開展葡萄次生代謝研究，特別是原花青素合成關(guān)鍵基因VvANR鮮見報道。

本研究利用TRV 介導的基因沉默技術(shù)，構(gòu)建攜帶VvANR特異基因序列的TRV 載體，通過真空侵染和主葉脈針孔注射法兩種方式對葡萄葉片中ANR基因進行沉默并對基因沉默后葡萄葉片進行表型觀察，旨在建立葡萄葉片的TRV-VIGS 系統(tǒng)，進而豐富和完善原花青素積累機制。

1 材料與方法

1.1 材料

前期研究發(fā)現(xiàn)，在無核早紅、早黑寶等葡萄葉片中進行VIGS 侵染，早黑寶葉片侵染漂白表型變化較為明顯，故選用山西省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所育成的四倍體歐亞種鮮食品種早黑寶為試驗材料。早黑寶葡萄栽植于山西農(nóng)業(yè)大學園藝站溫室，籬架，株行距2.5 m×1.0 m，常規(guī)管理。2019年7月17日15 時分別采集帶莖新梢作為侵染材料，現(xiàn)采現(xiàn)用。

VIGS 煙草脆裂病毒載體pTRV1 與pTRV2，根癌農(nóng)桿菌菌種GV3101 及實時熒光定量引物(表1)由山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院實驗室保存。克隆載體pMD18T、D2000 Marker、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，DH5α 大腸桿菌感受態(tài)購自北京全式生物公司，凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒中提試劑盒購自北京天根公司，反轉(zhuǎn)錄試劑購自北京索萊寶生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建 設(shè)計特異性引物(VvANR-F:5′-CGGGATCCAGTCTCCATTGCACATG-3′，VvANR-R:5′-CGG AATTCTCAATTCTGCAATAGCC-3′，劃線處為酶切位點)，以本實驗室前期反轉(zhuǎn)錄獲得的葡萄葉片cDNA(濃度100 ng·μL-1)為模板，94℃預變5 min、變性30 s，55.1℃退火30 s，72℃延伸50 s，34 個循環(huán)后再延伸5 min，PCR 擴增出307 bp 的VvANR片段，割膠回收此片段作為插入目的片段，16℃過夜連接克隆載體pMD18T，提取驗證正確序列的克隆載體pMD18T-ANR質(zhì)粒。經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，將VvANR基因片段反向插入pTRV2 中過夜連接獲得重組pTRV2-ANR質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞中，雙酶切驗證，華大基因科技股份有限公司測序，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 葡萄葉片病毒誘導基因沉默 取pTRV1、pTRV2、pTRV2-ANR的農(nóng)桿菌菌液各10 μL 接種到2 mL 的LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基(含50 mg·L-1卡那霉素)中，28℃、200 r·min-1活化17 h。將菌液活化后轉(zhuǎn)接到70 mL 的LB 液體培養(yǎng)基(含50 mg·L-1卡那霉素)中，28℃、180 r·min-1培養(yǎng)6 h 左右。當OD600約為1.0 時，取50 mL 菌液，4℃、5 000 r·min-1離心5 min，收集菌液，在含200 μmol·L-1乙酰丁香酮、10 mmol·L-1氯化鎂和10 mmol·L-12-嗎啉乙磺酸的誘導液中重懸菌液，計算并調(diào)整重懸菌液OD600至1.0。將pTRV1 菌液與pTRV2 菌液以等體積(1∶1)混合作為對照組，pTRV1 菌液與pTRV2-ANR菌液以等體積(1∶1)混合作為試驗組，黑暗室溫條件下靜置3～4 h。

式中，Vt:重懸菌液終體積；N:測量吸光值時的稀釋倍數(shù)；C0:稀釋N倍后的濃度，以O(shè)D600表示；V0:重懸菌液初體積；Ct:重懸菌液初濃度。

采集長勢健壯一致的早黑寶葡萄新梢90 個，幼嫩和成熟葉片各45 個，15 個葉片為一組，重復3 次。采用一次性無菌針孔器注射葉背主葉脈法時，左手戴一次性塑料手套，用大拇指輕輕固定葉背，右手持一次性無菌針孔器注射主葉脈，注射程度以針孔處出現(xiàn)液滴為宜。真空侵染法侵染葡萄幼嫩和成熟葉片10 min后取出，用濾紙輕輕擦拭葉面侵染液，將莖段插入盛有120 mL 蒸餾水的錐形瓶中，放于LED 型光照培養(yǎng)箱(光照強度2 000 lx，相對濕度70%，溫度25℃)中16 h/8 h 光暗交替培養(yǎng)，待葉片漂白表型出現(xiàn)后用液氮速凍葉片，-80℃超低溫保存待用。

1.2.3 原花青素含量測定 原花青素測定采用正丁醇-鹽酸法[36]并稍作修改，總酚提取參照陳建業(yè)[37]的方法。取總酚提取上清液50 μL，加入3.5 mL 正丁醇-鹽酸混合液(含0.3 g·L-1硫酸亞鐵)和1 mL 65%丙酮溶液，加熱煮沸30 min 后迅速放入冰盒降溫，室溫放置25 min 后在550 nm 下測定其吸光值，按標準曲線計算總酚提取液中的原花青素含量。

1.2.4VvANR基因瞬時表達分析 采用改良CTAB法[38]提取空載體pTRV1:pTRV2 和pTRV1:pTRV2-ANR侵染的陽性早黑寶葡萄葉片的總RNA，去除基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用實時熒光定量PCR分析pTRV2-ANR侵染后VvANR基因的相對表達量及其相關(guān)基因VvDFR、VvLAR1、VvLAR2、VvANS、VvUFGT、VvMYBPA1、VvMYBPA2 表達量，以空載體pTRV1:pTRV2 作為對照。以葡萄Actin為內(nèi)參基因。參照TB Green Premix Ex Taq Ⅱ北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司試劑盒說明，95℃預變性1 min；95℃變性30 s，55℃復性30 s，45 個循環(huán)，72℃收集熒光30 s，2-△△CT法計算基因相對表達量。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用Excel 2019 軟件進行數(shù)據(jù)處理，使用SAS 8.0 軟件進行差異顯著性分析，P＜0.01 代表極顯著性差異，P＜0.05 代表顯著性差異。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 pTRV2-ANR 載體構(gòu)建

以葡萄葉片cDNA 為模板，利用特異性引物VvANR-F/VvANR-R擴增出大約307 bp 的ANR片段(圖1-A)，將擴增的ANR片段回收后連接克隆載體pMD18T(圖1-B)，16℃過夜連接，成功構(gòu)建pTRV2-ANR載體，并經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切驗證(圖1-C)，測序一致性達91.53%(圖1-E)。將含有pTRV2-ANR載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 并進行菌液PCR鑒定，結(jié)果顯示擴增出ANR的目標片段(圖1-D)，表明pTRV2-ANR載體構(gòu)建成功且轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。

2.2 pTRV2-ANR 沉默表型

2.2.1 幼嫩葉片表型 真空侵染后早黑寶幼嫩葉片表型變化如圖2所示。6 d 后，葉片出現(xiàn)輕微漂白現(xiàn)象，侵染15 d 后幼嫩葉片幾乎全部漂白。主葉脈針孔注射幼嫩葉片表型變化如圖3所示。侵染17 d 后，幼嫩葉片出現(xiàn)漂白現(xiàn)象，在注射處沿主葉脈逐漸擴展到整個葉面，25 d 后，葉片幾乎全部漂白。

2.2.2 成熟葉片表型變化 真空侵染后早黑寶成熟葉片表型變化如圖4所示。7 d 后，葉片出現(xiàn)漂白現(xiàn)象，侵染15 d 后，成熟葉片出現(xiàn)大面積漂白。主葉脈針孔注射成熟葉片表型變化如圖5所示。侵染19 d后，成熟葉片出現(xiàn)漂白現(xiàn)象，25 d 后，葉片幾乎全部漂白。

2.3 原花青素含量

分別采用真空滲透法和主葉脈注射法沉默VvANR后，葡萄葉片中原花青素含量如圖6、圖7所示。真空侵染早黑寶幼嫩葉片和成熟葉片15 d 后，主葉脈針孔注射幼嫩葉片和成熟葉片25 d 后，原花青素含量相比對照下降，表現(xiàn)極顯著差異(P＜0.01)。

2.4 VvANR 基因及相關(guān)基因瞬時表達量分析

2.4.1VvANR基因表達分析 實時熒光定量PCR 結(jié)果表明，pTRV2-ANR沉默后，葉片中VvANR表達量極顯著降低(圖8)，表明本試驗所采用的真空滲透/主葉脈注射法，利用TRV 導致葡萄葉片中目標基因瞬時表達量顯著降低，成功實現(xiàn)了目標基因沉默。

2.4.2VvDFR、VvANS、VvLAR1、VvLAR2 表達分析 葡萄中，二氫黃酮醇還原酶(DFR)催化合成無色花色素，同時為ANS、LAR 提供合成底物[7]。沉默VvANR后，VvDFR表達量略有增加(圖9-A)，但差異不顯著，表明VvANR表達降低對VvDFR表達影響不大，或者說VvANR對VvDFR表達不存在調(diào)控作用?；ㄉ睾铣擅窤NS 作為ANR 的上游酶，催化合成花青素，為ANR提供合成底物。VvANR沉默后，VvANS表達量上調(diào)，但差異不顯著(圖9-B)。表明VvANR下調(diào)并未影響VvANS的表達。

隱色花色素還原酶(LAR)以無色花色素為底物，催化合成(＋)-兒茶素，為原花青素合成提供底物。VvANR沉默后，VvLAR1、VvLAR2 表達量明顯降低，且差異極顯著(圖9-C、D)。表明VvANR表達與VvLAR1、VvLAR2 表達存在協(xié)同，推測可能是由于ANR 催化產(chǎn)物表兒茶素和LAR 催化產(chǎn)物兒茶素均是原花青素的合成底物，同時原花青素中兒茶素、表兒茶素組成因物種而不同[39]，說明VvANR表達與VvLAR1、VvLAR2 表達密切相關(guān)。

2.4.3VvUFGT表達 類黃酮葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDPglucose:flavonoid-3-O-glucosyltransferase，UFGT) 以ANS 合成的花青素為底物，使不穩(wěn)定的花青素轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的花色苷[39-40]。沉默VvANR后，VvUFGT表達量下調(diào)，且差異顯著(圖10)，表明VvANR表達降低對VvUFGT表達具有一定的調(diào)控作用。其原因可能是，VvANR沉默使ANR 的活性降低，而UFGT 與ANR 競爭同一底物ANS，底物過量抑制了UFGT 的表達，導致VvUFGT表達降低，或者可能在沉默VvANR后，誘使VvUFGT表達降低的調(diào)節(jié)基因下調(diào)了VvUFGT表達。

2.4.4 轉(zhuǎn)錄因子VvMYBPA1、VvMYBPA2 表達 原花色素合成特異性轉(zhuǎn)錄因子VvMYBPA1、VvMYBPA2 表達量下調(diào)，差異極顯著(圖11)。這可能是由于VvANR表達極顯著下調(diào)后，導致原花青素生物合成因表兒茶素底物不足而受抑。表明VvANR作為原花青素合成中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因，對整個原花青素的生物合成具有決定性的作用。

3 討論

前人研究表明，葡萄病毒A(Grapevine virus A，GVA)可用于沉默煙草植物內(nèi)源八氫番茄紅素去飽和酶(phytoene desaturase，PDS)基因[35]，通過根癌農(nóng)桿菌接種體外微繁殖植株，而不是通過接種葉片或其他地上器官來建立病毒感染[41]。農(nóng)桿菌介導接種微繁殖葡萄可以沉默內(nèi)源PDS基因。PDS 是光合作用過程中類胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶，沉默PDS會引起沉默區(qū)域失綠，因此常作為VIGS 體系的指示基因。相比之下，TRV 具有高度易感性[42]，體內(nèi)外均可建立病毒感染。本試驗首次建立了葡萄葉片的TRV-VIGS 系統(tǒng)，證實了利用TRV 介導VIGS 載體接種葡萄葉片，可達到沉默葡萄VvANR基因的效果。農(nóng)桿菌介導接種可以通過農(nóng)桿菌注射、真空侵染等多種方式來實現(xiàn)[43]。本研究分別采用真空侵染法和針孔主葉脈注射法在葡萄葉片接種TRV-VIGS 構(gòu)建體，實現(xiàn)了VvANR基因沉默。

真空侵染法是一種高效的滲透方法。相比擬南芥摩擦接種后7～10 d 觀察到白化表型[44]，本研究真空侵染葡萄葉片6～15 d 即可觀察到漂白現(xiàn)象。這與Zhang 等[45]的結(jié)果相似，真空侵染極大地增加了VIGS有效性和持續(xù)時間[26]，比摩擦接種方式具有更完全的滲透效果，其侵染效果可能受植物葉齡的影響，葉齡太年輕或太年老會導致沉默效率低下[46]。VIGS 不僅用于成熟葉片的研究[47]。幼嫩植物的研究發(fā)現(xiàn)，在番茄2～3 片真葉期，農(nóng)桿菌滲透14 d 開始出現(xiàn)漂白，20 d出現(xiàn)特征性光漂白[48]。本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄幼嫩葉片對真空滲透非常敏感，侵染6 d 即出現(xiàn)葉片漂白，比成熟葉片漂白現(xiàn)象出現(xiàn)較早，且侵染15 d 后，幼嫩葉片比成熟葉片表現(xiàn)更均勻的特征性漂白現(xiàn)象。表明幼嫩葉片比成熟葉片更容易受到VIGS 的侵染，這與Wang等[18]和Zhang 等[45]的研究結(jié)果相同。

本研究采用的主葉脈針孔注射法，用于葡萄葉片基因沉默的研究，與葉柄、莖干注射2～3 周會引發(fā)沉默的結(jié)果相似[49]，可達到基因沉默。且辣椒在葉片主靜脈兩側(cè)打孔，21 d 后出現(xiàn)沉默[50]，而本研究葡萄幼嫩葉片、成熟葉片分別于17、19 d 出現(xiàn)漂白沉默，兩者出現(xiàn)沉默的時間均較早于葉背注射法，且幼嫩葉片出現(xiàn)沉默時間早于成熟葉片。前者可能是主葉脈疏導組織輸送病毒的能力比葉肉細胞強，病毒沿主葉脈快速到達各個分支葉脈，再擴展至整個葉片的葉肉細胞。后者可能由于幼嫩組織生長能力強于成熟組織，病毒蔓延能力也隨之快于成熟組織。由主葉脈針孔注射的表型變化可見，沉默從注射處開始，逐漸擴展到整個葉面直至全部漂白，這與Jeyabharathy 等[51]的研究結(jié)果類似。

此外，沉默效應在大多數(shù)情況下都是短暫的，其出現(xiàn)及持續(xù)時間因物種而異。例如，棉花、玉米幼苗[52]分別在2～3 周、10 d～3 周觀察到表型，大麥的VIGS效應會持續(xù)1～2 周。本試驗發(fā)現(xiàn)葡萄葉片真空侵染、主葉脈注射的沉默效應分別能持續(xù)6～15 d、17～25 d。相較之下，真空侵染比主葉脈注射出現(xiàn)沉默的時間較早，沉默持續(xù)時間稍長。沉默不同組織(如營養(yǎng)組織和生殖組織)的表型不同，沉默效應也通常在整株植物的部分或者幾個相連的植物器官中出現(xiàn)[53]。無效病毒的運動可以通過維持有利于系統(tǒng)病毒運動的條件來解決VIGS 不均勻或局部化[54]。例如，Burch-Smith等[55]為了在擬南芥中達到高效的沉默效果，均勻地手工接種整個葉片，而不使葉片老化。但對于2 周齡相對較小的真葉，手工接種通常會導致幼苗逃避接種或嚴重受傷。本研究通過主葉脈注射法能有效避免葉片的葉肉組織嚴重受傷，病毒從主葉脈較快且較均勻地沿網(wǎng)狀脈序蔓延至整個葉片，并可實現(xiàn)長期沉默，25 d后葉片不枯萎老化。

Jochen 等[56]發(fā)現(xiàn)葡萄葉片中編碼ANR、LAR 和LDOX 的基因在葉片生長過程中積累PA。煙草中的異位表達證實VvANR會導致PAs 相應增加，趨向于原花青素合成方向，ANR和LAR基因表達相應增加。同時，VvANR在全葉葉片發(fā)育中表達較高[56]。本研究表明，VvANR沉默后，幼嫩葉和成熟葉的原花青素含量均顯著降低，VvANR基因表達量相比對照也顯著降低，證實ANR 是導致原花青素積累的分支酶，正向調(diào)控催化原花青素生物合成。此外，VvANR沉默極顯著降低了VvLAR1、VvLAR2 表達量，也導致其下游基因VvUFGT表達量顯著降低。而其上游基因VvDFR和并列基因VvANS表達量略有上調(diào)，但差異不顯著。表明，VvANR沉默后對原花青素生物合成結(jié)構(gòu)基因都存在明顯的抑制作用，或者說VvANR對VvLAR和VvUFGT具有一定的調(diào)節(jié)作用。

Jochen 等[57]研究表明，VvMYBPA1 激活原花青素特異性分支基因VvANR和VvLAR1，而VvMYBPA2 對VvMYBPA1 的功能發(fā)揮也起到一定的協(xié)同作用。因此，VvMYBPA1 能通過調(diào)節(jié)VvANR的表達，從而影響原花青素的含量。本研究結(jié)果表明，VvANR沉默后，VvMYBPA1、VvMYBPA2 表達量極顯著降低。這表明特異性分支基因VvANR對VvMYBPA1、VvMYBPA2 表達具有一定的作用，可能存在反饋調(diào)節(jié)。推測其原因可能為，VvANR沉默導致VvDFR表達上調(diào)，其他MYB 類轉(zhuǎn)錄因子VvMYB5a、VvMYB5b等與VvMYBPA1、VvMYBPA2 競爭性表達，從而抑制了VvMYBPA1、VvMYBPA2 的作用。

4 結(jié)論

本研究建立了葡萄葉片的TRV-VIGS 系統(tǒng)。真空侵染和主葉脈注射均能在葡萄葉片中實現(xiàn)TRV 介導的基因沉默。主葉脈注射法侵染葡萄幼嫩葉片和成熟葉片，能短時間內(nèi)迅速漂白，漂白耗時少于真空侵染法。VvANR沉默后，葉片中原花青素含量極顯著降低，VvANR基因瞬時表達量極顯著降低；VvANR可能對VvDFR、VvANS不具有調(diào)控作用，但其對VvLAR和VvUFGT具有一定調(diào)節(jié)作用，且VvANR對原花青素調(diào)節(jié)基因VvMYBPA1、VvMYBPA2 具有反饋調(diào)節(jié)作用。