鄒峁雁 韓昊展 謝永娟 萬田英 涂書新

(1華中農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，湖北 武漢 430070；2土壤環(huán)境與污染修復湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430070)

隨著我國經濟社會的迅速發(fā)展，工業(yè)廢水排放、礦產資源開發(fā)以及農藥化肥的不合理使用等導致農田重金屬污染問題日益顯現[1]。砷是我國土壤污染的主要特征污染物之一，廣東、湖南、湖北、云南和貴州等地均存在不同程度的砷污染[2-3]。根據《全國土壤污染狀況調查公報》調查結果顯示，截止2013年底，全國砷污染點位超標率已達到2.7%[4]，是僅次于鎘的污染元素。砷在土壤中易積累、難降解，且隨著作物的生長，土壤中的砷被不斷吸收并通過食物鏈進入人體，對農田生態(tài)系統(tǒng)和人體健康構成嚴重危害。

目前，國內外主要利用物理、化學、植物等方式進行土壤砷污染修復[5-7]。但物理、化學修復因費用較高，難以大面積推廣應用[5]。植物修復采用超積累植物富集土壤中的砷，或采用耐砷性強、且低吸收植物以保障農產品中砷含量達到安全標準。研究發(fā)現，植物對砷的吸收、積累、敏感程度受自身遺傳因素的控制，其外部形態(tài)及內部結構存在差異，導致不同植物甚至同一植物的不同品種對重金屬吸收、積累能力有較大差異[6-7]。Srivastava 等[8]研究了18 種蕨類植物及4種蜈蚣草的砷累積特性，并篩選出3 種潛在的砷污染修復植物。熊雙蓮等[3]從196 個芥菜型油菜品種中篩選出2 個低吸收基因型、15 個砷排異基因型、5 個砷敏感基因型油菜品種。杜彩艷等[9]采用田間試驗，從8個玉米品種中篩選出3 個As、Pb、Cd 復合污染低積累的品種。陳菲[10]和竺朝娜[11]研究發(fā)現，植物成熟期耐砷性能與苗期結果一致，證實了可通過苗期耐砷性來評價植物或品種間砷耐性的差異，從而篩選耐砷性強且砷吸收量低的植物，在中、輕度砷污染土壤(≤40 mg·kg-1)上種植，可有效降低農產品的砷污染風險。

玉米(Zea maysL.)是世界上主要的作物之一，每年有約967 億t 玉米被用于食品、農業(yè)種植及工業(yè)生產[12]。在砷污染，尤其是中、高濃度砷污染土壤上種植玉米，會導致植株生長減緩，根系養(yǎng)分和水分吸收困難，葉片失綠發(fā)黃，光合作用減弱，植株矮小，最終導致玉米籽粒產量受抑制，同時使玉米籽粒砷含量超標[13]。目前有關砷脅迫對不同玉米品種種子萌發(fā)、幼苗生長影響的相關研究較少。因此，本研究擬通過水培試驗，以20 份主栽玉米品種為研究對象，通過研究砷脅迫對玉米種子萌發(fā)、幼苗生長、抗氧化酶活性和相關基因表達的影響，探討不同玉米品種對砷吸收、積累的差異性，篩選不同砷敏感型、耐受型玉米品種，旨在為中、輕度砷污染農田玉米生產提供砷耐受型種質資源，為提高玉米生長的安全性提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試20 個玉米品種信息如表1所示，種子均由中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所提供。

表1 供試玉米品種及栽種地區(qū)Table 1 Maize seed and its culture region

1.2 試驗設計

在預試驗的基礎上，選用0.5 mg·L-1的砷(NaAsO2)溶液對20 個品種的玉米種子進行處理。選取健康飽滿的玉米種子用10% H2O2(v/v)消毒15 min，自來水沖洗干凈后用蒸餾水再沖洗3 次以上，將種子用濕潤紗布包裹置于托盤12 h 后，播在鋪有細砂(預先消毒)的培養(yǎng)盤中，每品種均勻放入15 粒種子，處理組噴施含0.5 mg·L-1砷的營養(yǎng)液(營養(yǎng)液組分:硝酸鈣945 mg·L-1，硝酸鉀607 mg·L-1，磷酸銨115 mg·L-1，硫酸鎂493 mg·L-1，鐵鹽溶液2.5 mg·L-1，微量元素5 mg·L-1，pH 值6.0)，同時以不含砷的營養(yǎng)液噴施作為對照(CK)，每處理重復3 次，各處理每天噴施相應營養(yǎng)液3～5 次以保持細沙潤濕。

待玉米幼苗長至兩葉一心時，選擇大小一致的幼苗進行水培試驗。水培試驗在人工氣候控制室內進行，室內條件為溫度26℃，相對濕度70%，光照條件14 h 冷白熒光光源、10 h 無光源，燈管的平均光子通量密度820 μmol·m-2·s-1。處理組施用含0.5 mg·L-1砷的改良霍格蘭營養(yǎng)液(相比于霍格蘭營養(yǎng)液，磷濃度減半)，CK 施用改良霍格蘭營養(yǎng)液，每處理均重復3 次。營養(yǎng)液2 d 更換1 次，培養(yǎng)20 d 后取樣。

取樣時將植物用蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸干水分后立即稱量鮮重、測量根莖長，然后將植物樣分為兩部分:一部分樣品放入-80℃超低溫冰箱中保存待測各項生理指標等，另一部分樣品分成地上部和地下部，105℃殺青后于65℃烘48 h 至恒重后備用。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 種子發(fā)芽勢及發(fā)芽率 發(fā)芽期間，每天觀察種子的發(fā)芽情況，以種皮上可見初生根作為突起標志，以胚根長0.2 cm 作為萌芽標志，分別于第3 天觀察突起的種子數量，于第7 天觀察發(fā)芽的種子數量[14]:

1.3.2 植物根長、株高及干重 于砷處理20 d 后用毫米尺測量每株植物樣品的主根長度和株高，殺青烘干至恒重后稱量每株植物的干重[14]。

1.3.3 植株砷含量 植物鮮樣用HNO3＋HClO4消化后，采用AFS-8510 原子熒光光度計(北京海光)測定[14]。根據公式計算砷轉運系數:

1.3.4 生理指標 抗氧化酶系統(tǒng)指標測定:取葉片鮮樣，用磷酸鈉緩沖液制備酶提取上清液，使用南京建成科技有限公司試劑盒分別測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和過氧化物酶(peroxidase，POD)活性。

抗氧化非酶系統(tǒng)指標測定:取葉片鮮樣，用5%三氯乙酸制備非酶提取物上清液，丙二醛(malondialdehyde，MDA) 含量測定采用TBA 比色法[14]，谷胱甘肽(glutathione，GSH) 和抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)含量使用南京建成科技有限公司試劑盒測定。

1.3.5 基因表達 將存于-80℃冰箱的最耐受型品種與最敏感型品種新鮮樣品葉片送至上海美吉生物公司進行基因表達檢測，利用生信云平臺(I-Sanger)進行轉錄本表達量差異分析。

1.4 數據分析

采用SPSS 24.0 和Microsoft Excel 2019 軟件進行數據處理，利用鄧肯數法對處理均值進行比較。樣本的聚類分析為Q 型，采用最遠鄰元素法進行分析。

2 結果與分析

2.1 砷處理對玉米種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響

由圖1和表2可知，與CK 相比，在砷處理條件下，20 個供試玉米品種的發(fā)芽勢和發(fā)芽率差異明顯。處理組的發(fā)芽勢在23.33%～93.33%之間，20 個供試玉米品種的均值為61%，變異系數31%；發(fā)芽率在36.67%～96.67%之間，20 個供試玉米品種的均值為72%，變異系數23%。由表2可知，20 個供試玉米品種中，有13 個玉米品種的發(fā)芽勢和發(fā)芽率較CK 下降，其中蠡玉6 號和三北89 的發(fā)芽勢和發(fā)芽率下降最為明顯，發(fā)芽勢分別較CK 下降63.34 和22.22 個百分點，發(fā)芽率分別較CK 下降33.34 和23.33 個百分點；僅康農玉999 的發(fā)芽勢與發(fā)芽率均較CK 提高，分別提高10.47 和12.18 個百分點。。

2.2 砷處理對玉米幼苗生長的影響

由表2可知，與CK 相比，砷處理總體對不同玉米品種的根長、株高影響較小。處理組的根長介于11.75～23.71 cm 之間，20 個供試玉米品種的均值為19.10 cm，變異系數18%；株高介于27.50～58.86 cm之間，均值為48.22 cm，變異系數14%。由圖2和表2可知，有14 個品種根長的處理/CK 比值介于0.7～1.0之間，說明砷處理對大部分參試玉米品種的根部生長無影響或有輕微抑制作用；僅有4 個品種的根長在處理組較CK 降低30%以上，其中惠玉908 的根長在砷處理條件下較CK 下降51%?？梢娚樘幚韺@4 個品種的根部生長抑制作用較明顯。另有2 個品種在處理組的根長高于CK，其中綿單1273 增加最明顯，達到4%，說明砷處理對于這2 個品種根部生長有輕微的促進作用。有14 個品種株高的處理/CK 比值介于0.7～1.0 之間，說明處理組的株高整體較CK 略有降低；其余6 個品種在處理組的株高均高于CK，其中正大999在處理組的株高比CK 增加14%。綜合來看，有13 個品種的根長、株高均較CK 降低，綿單1273 的根長、株高均較CK 增加?？梢娚樘幚韺Υ蟛糠钟衩灼贩N的株高有輕微抑制作用或無影響，對少數品種有輕微促進作用。

由表2可知，砷脅迫對不同玉米品種干重影響差異較大。處理組干重介于0.21～0.57 g/株之間，20 個供試玉米品種的均值為0.39 g/株，變異系數27%。由圖3和表2可知，有10 個玉米品種的處理組干重高于CK，其中登海605 增加最明顯，處理組干重相比于CK增加了183%。其他10 個玉米品種在處理組的干重均低于CK，平均降低20%，其中三北89、科玉1108、康農玉007 在處理組的干重較CK 下降幅度大于30%，可見砷處理對這3 個品種有較強的抑制作用。

表2 砷處理供試玉米種子及植株生長的影響Table 2 Effects of As treatment on germination of maize seed and growth of plants

2.3 砷處理對玉米植株砷含量的影響

由表2可知，砷處理組地上部砷含量介于0.51～13.05 mg·kg-1之間，20 個供試玉米品種的均值為6.82 mg·kg-1，變異系數48%。根部砷含量介于20.00～446.07 mg·kg-1之間，20 個供試玉米品種的均值為220.01 mg·kg-1，變異系數43%。進一步分析地上部砷含量發(fā)現，低于3 mg·kg-1的玉米品種有科玉1108和成單808 號，高于9 mg·kg-1的玉米品種有青青009、蠡玉6 號、登海9 號、聯創(chuàng)808。20 個供試玉米品種砷轉運系數介于0.016～0.070 之間，其中美加303、敦玉518、科玉1108、同玉609 等4 個品種的砷轉運系數最低，介于0.016～0.018 之間；正大999、聯創(chuàng)808 玉米品種的砷轉運系數較高，均不低于0.060。

2.4 主成分分析

對20 個玉米品種的12 個指標進行主成分分析，結果如表3所示，提取特征值大于1 的前4 個主成分累積貢獻率達到81.557%，基本能夠反映全部指標的大部分信息，說明該結果符合主成分分析要求，可以用這4 個主成分來代替12 個指標對20 個玉米品種的耐砷性能進行評價。

第1 主成分特征值最大，為4.1，貢獻率為34.163%，載荷較高且為正的指標有株高處理/CK、處理株高，其特征向量值分別為0.728、0.803，這些指標均與株高有關。載荷負向較高的有發(fā)芽勢處理/CK、發(fā)芽率處理/CK、處理發(fā)芽勢、處理發(fā)芽率，特征向量分別為-0.712、-0.726、-0.846、-0.769，這些指標均與發(fā)芽狀況有關。因此第1 主成分可以視為株高和發(fā)芽狀況的綜合指標，株高與發(fā)芽狀況的特征向量數據相反，發(fā)芽狀況制約著株高。

表3 20 個供試玉米品種種子發(fā)芽生理指標的主成分分析Table 3 Principal component analysis of germination and physiology indicators of twenty maize varieties

第2 主成分特征值為2.259，貢獻率為18.824%，特征向量正向較高的指標有砷轉運系數、干重處理/CK、處理干重，其特征向量值分別為0.712、0.602、0.554。因此第2 主成分可以視為砷轉運系數和干重的綜合指標。

第3 主成分特征向量正向較高的指標有根長處理/CK、處理根長，其特征向量值分別為0.656、0.659。因此第3 主成分可以視為根長等方面的綜合指標。

第4 主成分特征向量正向較高的指標有處理發(fā)芽率、地上部砷含量，其特征向量值分別為0.488、0.448。載荷負向較高的指標是處理干重，其特征向量值為-0.473。因此第4 主成分可以視為處理發(fā)芽率、地上部砷含量和處理干重的綜合指標，處理干重特征向量為負，所以處理干重制約著地上部砷含量和處理發(fā)芽率。

為了更好地評價不同玉米品種的耐砷性能，利用指標特征值和各主成分的特征值計算各主成分的對應表達式系數(表達式系數=指標特征值/SQRT 主成分特征值)，得到4 個主成分的表達式，并進一步將4 個主成分表達式轉化為1 個綜合評價表達式F(各主成分表達式系數乘以其貢獻率之和再除以總貢獻率):

F =-0.111X1-0.119X2＋0.221X3＋0.055X4＋0.199X5＋0.115X6-0.119X7-0.081X8＋0.115X9＋0.153X10＋0.209X11＋0.249X12

式中，X1～X12分別表示試驗品種各指標標準值，分別為發(fā)芽勢處理/CK、發(fā)芽率處理/CK、干重處理/CK、根長處理/CK、株高處理/CK、處理干重、處理發(fā)芽勢、處理發(fā)芽率、處理根長、處理株高、地上部砷含量、砷轉運系數。將12 項指標值進行標準化處理，代入綜合評價表達式，計算各品種的綜合評價值并進行排名[15]。根據綜合評價值排名結果，前5 名分別為康農玉999、康農玉007、科玉1108、同玉609、成單8008號，可將其視為耐受型品種，后5 名分別為正大999、登海605、登海9 號、三北89、綿單1273，可將其視為敏感型品種，其余品種可視為普通型品種。

2.5 聚類分析

以主成分分析中的12 個指標對20 個玉米品種進行Q 型聚類分析[16]。由圖4可知，在歐氏距離為10處劃分，可將20 個品種劃分為3 類，即耐受型、普通型和敏感型。耐受型品種共計4 個，由康農玉999、騰龍168、山單9 號、成單808 號組成；普通型品種共計7個，由青青009、康農玉007、敦玉518、科玉1108、同玉609、惠玉908、林單3121 組成；敏感型品種共計9 個，由蠡玉6 號、正大999、登海605、登海9 號、康農玉108、三北89、美加303、綿單1273、聯創(chuàng)808 組成。

主成分分析與聚類分析2 種方法所篩選出的耐受型和敏感型品種基本一致。結合2 種篩選方法得到耐受型品種有2 個，分別為康農玉999、成單808 號，得到敏感型品種5 個，分別為正大999、登海605、登海9號、三北89、綿單1273，其余13 個品種均為普通型品種。進一步對比12 項測試指標，確定最耐受型品種為康農玉999，最敏感型品種為三北89。

2.6 砷處理對玉米抗氧化系統(tǒng)的影響

本研究進一步對耐受型品種康農玉999 和敏感型品種三北89 進行抗氧化系統(tǒng)分析，結果如表4所示。耐受型品種康農玉999 在砷處理條件下，3 種抗氧化酶活性均低于CK，其中CAT、POD 活性分別較CK 降低10%和7%，差異不顯著，而SOD 活性顯著降低71%；其抗氧化非酶物質MDA、GSH、AsA 含量則均顯著高于CK，分別增加26%、21%、114%。敏感型品種三北89 在砷處理條件下其SOD、CAT 活性分別較CK增加23%、42%，POD 活性與CK 無顯著差異；其抗氧化非酶物質GSH、AsA 含量分別較CK 增加125%、39%，而MDA 含量則較CK 降低50%。

表4 不同砷抗性玉米品種的抗氧化、氧化物質含量Table 4 Antioxidant and oxidant content in different arsenic resistant maize varieties

2.7 玉米樣品基因表達分析

對篩選所得耐受型玉米品種康農玉999 和敏感型玉米品種三北89 進行基因表達分析。根據遺傳中心法則，遺傳物質由DNA 經RNA 最終傳遞給蛋白質，所以通過分析mRNA(轉錄本)的表達量即可得知基因表達情況[17-18]。統(tǒng)計2 個樣本的轉錄本表達量，共計存在138 270 個差異(圖5)，其中4 852 個為顯著性差異。從Pfam 數據庫中獲得表達量有顯著性差異的轉錄本功能注釋表，以“ars”作為關鍵詞進行全面搜索[19-20]，獲取到5 個與植物抗砷性相關的轉錄本(表5)，包括4 個與泵砷膜蛋白(ArsB)合成相關的轉錄本和1 個與亞砷酸鹽-激活ATP 酶(ArsA)合成相關的轉錄本。

由表5可知，與耐受型品種康農玉999 相比，敏感型品種三北89 有4 個抗砷相關轉錄本表達量出現明顯上升，包含3 個ArsB 相關轉錄本和1 個ArsA 相關轉錄本，只有1 個ArsB 相關轉錄本表達量出現輕微下降。ArsA 是一種依靠砷激活的ATP 酶，ArsB 是一種內膜蛋白，可為砷離子排出細胞提供通道，二者共同作用可促進砷的排出[21]。根據以上結果，推測耐受型品種因為植物體內砷含量低，不需要通過主動運輸將砷離子排出體外，所以相關轉錄本表達量較低；而敏感型品種因其對砷敏感，所以體內砷含量較高，相關基因得到激活進而轉錄形成轉錄本，建立了排砷機制，以減少砷對自身的危害。

表5 耐受型品種康農玉999 和敏感型品種三北89 的轉錄本表達量差異Table 5 Differential expression of transcripts of tolerant cultivar Kangnongyu 999 and sensitive cultivar Sanbei 89

3 討論

Javed 等[22]發(fā)現多數植物在重金屬脅迫環(huán)境中逐漸形成了避性機制和耐性機制。外界環(huán)境脅迫對植物的影響可以通過植物的形態(tài)學特征表現出來[3]。營養(yǎng)液中砷等重金屬脅迫的存在會破壞細胞膜的結構和功能[23]，影響種子的細胞分裂，對種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率有明顯影響。植物的生長參數如株高、根長、生物量等易對各種脅迫敏感，從而被用作植物對金屬毒性的耐受性指標[3]。本研究通過考察20 個玉米主栽品種在0.5 mol·L-1砷脅迫條件下，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根長、莖長、干重等5 個生長參數及莖部和根部砷含量來初步篩選玉米的耐受型和敏感型品種。結果顯示，砷脅迫條件下各品種的生長參數差異較大，各品種玉米種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、干重、根長以及莖長的處理/CK 比值在1 左右均有分布。由此可知，部分供試玉米品種的生長不僅未受到砷脅迫的抑制，反而被微量砷處理刺激了植物的生長發(fā)育[24]，這可能是因為少量的砷可以促進部分玉米品種對某些營養(yǎng)元素的吸收，從而促進玉米的生長[25-26]。王效瑾等[27]有關小麥幼苗根系形態(tài)對鎘脅迫的響應研究也得出類似結論；而過量的砷使葉綠素的合成受阻，抑制光合作用[28]，并導致葉面蒸騰速率下降，阻礙作物對水分的吸收及水分由根部向地上部的運輸[29]。從而使得部分玉米品種的生長受到限制。在采用多項指標進行綜合評價分析時，由于指標數量多而且指標之間相互關聯，導致分析工作比較困難。主成分分析可將多個主要指標轉化為較少的幾個綜合、相對獨立的主成分，被廣泛應用于多項指標綜合評價分析中[30]。本研究應用主成分分析方法，將20 個玉米品種的12 個指標簡化成4 個主成分，這4 個主成分累計方差貢獻率達81.557%，根據綜合評價值對不同玉米品種的抗砷性能排序。同時應用Q 型聚類分析將20 個品種劃分為耐受型、普通型和敏感型3 類。結合2 種篩選方法得到耐受型品種2 個，敏感型品種5 個，普通型品種13 個，其中最耐受型品種為康農玉999，對比5 個敏感型品種的12 項指標確定最敏感型品種為三北89。

三北89 地上部和根部砷含量分別為6.51、279.30 mg·kg-1，其地上部、根部砷含量分別是康農玉999 相應部位砷含量的2.0 倍、2.3 倍。敏感型品種三北89 和耐受型品種康農玉999 的轉運系數分別是0.023 和0.026。由此可見，相比耐受型品種，敏感型品種對砷的吸收量更大。對二者進行基因表達分析可推測，三北89 對砷的吸收存在防御機制致使體內砷含量較高，過高的砷含量導致三北89 體內與排砷相關蛋白基因被激活，對應轉錄本得以進行表達。而康農玉999 對砷的吸收能力較低，所以其體內砷含量相對較低，與砷排出相關蛋白基因表達不明顯，尤其是為排砷提供ATP 的ArsA 表達量較少。

在重金屬脅迫下植物體內活性氧自由基不斷積累增加，導致細胞膜受損[31]，同時，植物啟動抗氧化防御機制，合成抗氧化系統(tǒng)如SOD、CAT、POD、GSH、AsA以清除金屬的毒性作用[32]。本研究對篩選出的耐受型品種康農玉999 和敏感型品種三北89 進行抗氧化系統(tǒng)分析，結果表明，與CK 相比，砷脅迫下耐受型品種康農玉999 的SOD、CAT、POD 活性均降低，敏感型品種三北89 則相反；在非酶物質方面，砷脅迫下耐受型品種康農玉999 的MDA、GSH、AsA 含量升高，敏感型品種三北89 的MDA 含量降低，而GSH、AsA 含量升高。這可能是由于敏感型品種體內砷含量較高，導致其體內抗氧化酶活性升高，以清除砷脅迫下過量活性氧，維持活性氧的代謝平衡、保護膜結構[33]，使得MDA 含量下降；耐受型品種由于本身具有一定的阻礙能力，體內砷含量較低，所以0.5 mol·L-1砷脅迫對體內抗氧化酶CAT 和POD 活性的促進作用不顯著，導致MDA 含量升高。此外，砷積累可增加植物對磷素的吸收，同時促進植物體內GSH 含量上升[34]，并且AsA-GSH 循環(huán)可清除過量H2O2[35]，同時提高AsA 的含量。由于在相同外源砷濃度處理下，耐受型與敏感型品種體內的砷濃度不同，因此，耐受型與敏感型品種在砷脅迫下有不同的抗氧化系統(tǒng)活性。

4 結論

本研究分析了20 個玉米品種種子的發(fā)芽生理和抗氧化系統(tǒng)的差異，表明在砷脅迫下，玉米品種的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、干重、根長、株高的處理/CK 及砷轉運系數變異較大，小部分品種表現出低濃度砷輕微刺激生長的現象，而惠玉908 受到明顯抑制。通過主成分分析和聚類分析，篩選出耐受型品種2 個，敏感型品種5個，其中康農玉999 為最耐受型品種，三北89 為最敏感型品種，表現為與CK 相比，砷脅迫下耐受型品種康農玉999 的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、干重均提高，抗氧化酶SOD、CAT、POD 活性均降低，抗氧化非酶物質MDA、GSH、AsA 含量均增加；而敏感型品種三北89 砷含量高于耐受型康農玉999，與CK 相比，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、干重均較CK 降低，抗氧化酶SOD、CAT、POD 活性均升高，抗氧化非酶物質含量總體上升。通過檢測基因表達水平推測，耐受型品種主要通過抑制自身對砷的吸收而減弱其發(fā)芽生長中所受到的砷毒影響。本研究僅進行了苗期試驗，為進一步了解這2 個玉米品種在砷脅迫條件下的生長情況，可研究各生長部位尤其是玉米籽粒的砷含量變化，并落實到實際生產中，并進一步在砷污染土壤上進行全生育期試驗。