陳 珂 王瑩瑩 楊 悅 曹嘉懿 曹旭鵬 徐繼林

(1寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所催化基礎(chǔ)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

海洋微藻具有生長(zhǎng)周期短、生物量產(chǎn)率高、營(yíng)養(yǎng)組成豐富、培養(yǎng)占地面積小等特點(diǎn)，近年在養(yǎng)殖飼料、生物能源、生態(tài)治理、食藥保健等領(lǐng)域備受關(guān)注[1-3]。湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)作為一種無(wú)細(xì)胞壁、易培養(yǎng)且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值特殊(富含二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸)的海洋微藻，在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域已有大規(guī)模的應(yīng)用[4]，尤其在我國(guó)南方的大規(guī)模海水貝類工廠化育苗中，其作為一種重要的海水貝類幼苗開口餌料應(yīng)用[5-7]。金藻的最適宜生長(zhǎng)溫度為25℃[8]，然而我國(guó)南方夏季藻類培養(yǎng)池水體溫度能達(dá)到35℃[9]，夏季高溫嚴(yán)重制約了金藻的生長(zhǎng)和擴(kuò)繁，從而導(dǎo)致較高的生產(chǎn)成本和風(fēng)險(xiǎn)。

目前已有關(guān)于藻類高溫響應(yīng)機(jī)制的研究，如在多細(xì)胞藻類海帶中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)對(duì)高溫存在響應(yīng)，高溫使海帶體內(nèi)的活性氧含量增高，細(xì)胞膜的通透性增加，從而影響到海帶細(xì)胞體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)活性[10]；在石莼中，熱激應(yīng)答元件(heat shock element，HSE)和低溫響應(yīng)元件(low temperature responsive element，LTR)因子可能是適應(yīng)高溫潛在分子熱激蛋白70 基因(hsp70)的靶點(diǎn)，其下游的靶基因所編碼的熱激蛋白會(huì)對(duì)細(xì)胞器的膜系統(tǒng)穩(wěn)定性和功能加以保護(hù)[11]；在微藻細(xì)胞中，高溫抑制了光系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)的電荷分離活性，鈍化了PS Ⅱ的氧化能力[12]。研究還發(fā)現(xiàn)，微藻藻際微生物組成與藻類生長(zhǎng)之間存在重要聯(lián)系，它能夠參與調(diào)控藻類的生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)組成、代謝產(chǎn)物分泌等重要的生命活動(dòng)[13-15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫條件下原核微生物與其共生藻類形成的微環(huán)境能為珊瑚宿主提供一種適應(yīng)高溫脅迫的補(bǔ)償機(jī)制，這些原核微生物能夠通過(guò)光合作用、固定碳源等方式增強(qiáng)珊瑚本身的耐熱性[16-17]。且目前已在番茄和高粱中發(fā)現(xiàn)，根瘤菌可以增強(qiáng)植物高溫抗逆性[18-19]。但在微藻耐高溫性狀與其藻際微生物群落間關(guān)系方面的研究仍然有限，因此解析藻際細(xì)菌與微藻耐高溫能力之間關(guān)聯(lián)的研究具有重要意義。本試驗(yàn)以湛江等鞭金藻及其耐高溫誘變株為研究對(duì)象，運(yùn)用16S rDNA 擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)比較了這兩株藻在高溫條件(35℃)下藻際微生物組成的差異，解析微生物組成與耐高溫能力的關(guān)系，以期為提高水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中餌料微藻的高溫抗逆性提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)條件

湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis，IZ)，保藏編號(hào)為FACHB-1750，由中國(guó)科學(xué)院水生生物物種種質(zhì)庫(kù)提供。湛江等鞭金藻耐高溫誘變株(IM)由中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所采用常壓室溫等離子體技術(shù)誘變篩選獲得[20]。兩株湛江等鞭金藻在無(wú)菌寧大三號(hào)(NMB3＃)固體培養(yǎng)基純化并保存[21]。

兩株金藻均培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱中，置于正常培養(yǎng)溫度(25℃)和高溫(35℃)下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為4 000 lx，光周期為光∶暗=12 h∶12 h。培養(yǎng)基采用NMB3＃配方培養(yǎng)基，培養(yǎng)所需海水均高溫滅菌處理冷卻后使用。

1.2 藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定及樣品采集

藻細(xì)胞計(jì)數(shù)主要采用血球計(jì)數(shù)法[22]。將藻液用盧戈碘液固定后取40 μL 混勻的藻液均勻滴入蓋有蓋玻片的血球計(jì)數(shù)板中，放置在光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)觀察并計(jì)數(shù)，目鏡放大10 倍，物鏡放大40 倍，每天計(jì)數(shù)一次。

根據(jù)兩株金藻的生長(zhǎng)情況，分別在25℃和35℃條件下取第3 天指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期的藻液50 mL，收集25℃野生株組(IZ25L)、25℃誘變株組(IM25L)、35℃野生株組(IZ35L)和35℃誘變株組(IM35L)藻液，各組分別收集3 個(gè)重復(fù)樣品。將所有樣品依次通過(guò)0.22 μm的聚碳酸酯膜(Millipore，美國(guó))進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，獲得藻際細(xì)菌，將收集好的濾膜分別放置于不同的無(wú)菌離心管中液氮速凍保存。

1.3 樣品基因組DNA 的提取及PCR 擴(kuò)增與高通量測(cè)序

采用CTAB 法對(duì)所有樣本的基因組DNA 進(jìn)行提取，提取后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的純度和濃度。將獲得的合格基因組DNA 送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行后續(xù)PCR 擴(kuò)增及測(cè)序。以稀釋后的基因組DNA 為模板，選擇各樣本總DNA 上16S rDNA 基因的V3-V4 高變區(qū)序列擴(kuò)增，使用帶Barcod的引物 341F (CCTAYGGGRBGCASCAG) 和 806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度將樣品進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，使用德國(guó)QIAGEN 公司膠回收試劑盒回收目的條帶的產(chǎn)物。文庫(kù)構(gòu)建使用 TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫(kù)試劑盒(諾禾致源，北京)進(jìn)行，而后通過(guò)Qubit(Thermo Scientific，美國(guó))檢測(cè)和Q-PCR(quantitative real-time PCR)定量構(gòu)建合格文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析

基于Illumina NovaSeq 測(cè)序平臺(tái)，利用Qiime 軟件對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，得到質(zhì)量較高的有效數(shù)據(jù)[23]。利用Uparse 軟件將所有樣本的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元(optional taxonomic unit，OTU)聚類，同時(shí)篩選聚類相似度為97%[24]中出現(xiàn)頻率最高的OTU作為其代表序列。采用Mothur 方法對(duì)獲得的OTU 代表序列進(jìn)行物種分類學(xué)處理(設(shè)定閥值為0.8)，參照SILVA 的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種比對(duì)注釋[25]，注釋時(shí)刪除古細(xì)菌、葉綠體和未知序列。為消除因測(cè)序深度不同引起的樣本間多樣性評(píng)估偏差，對(duì)各樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，以其中數(shù)據(jù)量最少的樣本為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)基于均一化處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行Alpha 多樣性分析和Beta 多樣性分析。

1.5 藻際可培養(yǎng)細(xì)菌分離與鑒定

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的藻液按照藻液∶培養(yǎng)液=1∶9(體積比)的比例進(jìn)行稀釋，稀釋至細(xì)胞密度為10-1～10-5，取100 μL 的各稀釋濃度樣品用平板涂布法均勻涂布在2216E 固體平板培養(yǎng)基上。將平板放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)數(shù)日，每日觀察平板的細(xì)菌生長(zhǎng)情況(菌落顏色、形態(tài)和大小)，再挑取可操作的單一菌落置于新的2216E 固體培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線法純化，最終得到單克隆菌株。

對(duì)分離所獲得的各菌株，采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒分別進(jìn)行提取。以提取后的總DNA 為模板，27F(5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件參考孔周雁等[26]的方法。將PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，使用凝膠回收試劑盒純化，并連接至pMD19-T 載體后送至杭州有康生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將從公司所測(cè)得的16S rDNA 基因序列全長(zhǎng)輸入NCBI 網(wǎng)頁(yè)進(jìn)行BLAST 比對(duì)同源相似性最高的物種序列。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

MetaStat 分析使用R 軟件在種水平下，做組間的置換檢驗(yàn)，得到p 值，然后利用Benjamini and Hochberg False Discovery Rate 方法對(duì)于p 值進(jìn)行修正，得到q值[27]。利用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)湛江等鞭金藻生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫條件下湛江等鞭金藻野生株和突變株生長(zhǎng)差異比較

在25℃和35℃條件下野生株IZ 與誘變株IM 之間的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。由圖1-A 可知，在25℃培養(yǎng)條件下，野生株與誘變株生長(zhǎng)趨勢(shì)基本相同，且藻的細(xì)胞密度無(wú)顯著差異；在35℃培養(yǎng)條件下，野生株與誘變株生長(zhǎng)趨勢(shì)基本相同，但誘變株IM 每天的藻細(xì)胞密度高于野生株IZ，且在第4～第10 天差異顯著，說(shuō)明在35℃下誘變株IM 的高溫耐受性明顯強(qiáng)于野生株IZ。

2.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

4 組樣品測(cè)序共計(jì)獲得804 756 條有效序列，組間平均有效序列獲得率為69.64%～75.20%，表明各組測(cè)序結(jié)果能基本反映各組樣本中的大多數(shù)細(xì)菌類群情況(表1)。在指數(shù)生長(zhǎng)期，25℃下兩株藻細(xì)菌類群的Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)無(wú)顯著性差異，但誘變株的藻際細(xì)菌類群的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)顯著高于野生株；35℃下兩株藻細(xì)菌類群的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)無(wú)顯著性差異，但誘變株的Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)顯著高于野生株。這說(shuō)明指數(shù)期溫度升高可促使誘變株藻際細(xì)菌豐富度顯著增加。

OTU 聚類結(jié)果顯示4 組樣本中共有OTU 數(shù)量為87 個(gè)，其中IM35L 組中的特有OTU 數(shù)量遠(yuǎn)高于其他組別(圖2)，進(jìn)一步說(shuō)明該組的藻際細(xì)菌豐富度最高。

2.3 藻際細(xì)菌群落多樣性分析

表1 各樣品組所檢測(cè)到的有效數(shù)據(jù)及多樣性指數(shù)Table 1 The effective tags and diversity indices of each sample group

在OTU 水平上，基于Binary-Jaccard 距離對(duì)所有樣本進(jìn)行無(wú)度量多維標(biāo)定法(non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析，其中橫坐標(biāo)為MDS1，縱坐標(biāo)為MDS2，且該NMDS 的Stress 值為0.086，小于0.2，說(shuō)明NMDS 可以準(zhǔn)確反映樣本間的差異程度(圖3)。在MDS1 維度中四組樣品點(diǎn)，組內(nèi)樣品差異基本小于組間樣品差異，能夠較為直觀地反映四組樣品間的差異。25℃下兩株金藻樣本點(diǎn)聚集在MDS1 的負(fù)半軸，且整體較為聚集，說(shuō)明25℃下兩株金藻的藻際細(xì)菌群落多樣性較為相似。但35℃下，IM 和IZ 樣本點(diǎn)分別位于MDS1 的正負(fù)半軸且兩組樣本點(diǎn)組間較為離散，說(shuō)明35℃下兩株金藻的藻際細(xì)菌群落多樣性有明顯差異。說(shuō)明高溫條件下兩株藻藻際細(xì)菌存在明顯差異。

2.4 藻際細(xì)菌群落組成差異及比較分析

在門水平上(圖4-A)，各組樣品檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)菌種有一定的相似性，各組樣品均以變形菌門(Proteobacteria) 為主要優(yōu)勢(shì)菌門，其相對(duì)豐度達(dá)91.57%～97.01%；其次為擬桿菌門(Bacteroidetes)，相對(duì)豐度達(dá)1.54%～6.28%，其他優(yōu)勢(shì)菌種還包括厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)等。

在屬水平上(圖4-B)，經(jīng)檢測(cè)后四組樣品中細(xì)菌群落組成差異明顯。除未知屬外(Others)，IZ25L 組、IM25L 組和IZ35L 中相對(duì)豐度最大的前三屬相同，為海桿菌屬(Marinobacter)、拉布倫茨氏菌(Labrenzia)、海洋柄菌屬(Oceanicaulis)；而IM35L 組中相對(duì)豐度最大前三屬分別是拉布倫茨氏菌(Labrenzia)、海洋柄菌屬(Oceanicaulis)和噬冷菌屬(Algoriphagus)，這說(shuō)明噬冷菌屬在該組中的相對(duì)豐度明顯提高，隸屬于該屬的細(xì)菌可能與IM 的耐高溫性狀有關(guān)。

2.5 藻際細(xì)菌群落間差異物種分析

為了研究組間具有顯著性差異的物種，利用MetaStat 方法對(duì)組間的物種豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)得到p 值，通過(guò)對(duì)p 值的校正，得到q 值，最后根據(jù)q 值經(jīng)過(guò)t 檢驗(yàn)篩選得到具有顯著性差異的兩株菌種。其中，在35℃下，變形菌門紅螺菌目的阿爾法變形菌DG1252(Alpha proteobacteriumDG1252)在誘變株中的豐度顯著高于野生株，但在25℃下豐度差異不顯著，說(shuō)明變形菌門的阿爾法變形菌DG1252 在高溫條件可能為促進(jìn)湛江等鞭金藻誘變株生長(zhǎng)的重要菌種；聚團(tuán)拉布倫茨氏菌(Labrenzia aggregata)在25℃下兩株藻之間豐度差異顯著，但在35℃下菌種豐度差異不顯著。

2.6 湛江等鞭金藻野生型和誘變型藻際可培養(yǎng)細(xì)菌的分離和鑒定

使用培養(yǎng)基配方為2216E 的平板進(jìn)行涂布平板分離法對(duì)兩種藻株的藻際細(xì)菌進(jìn)行分離，經(jīng)過(guò)初步分分離和鑒定得到4 株野生型的藻際細(xì)菌(編號(hào)為IZ-1、IZ-3、IZ-4 和IZ-5)和5 株誘變型的藻際細(xì)菌(IM-1、IM-2、IM-3、IM-4 和IM-5)，細(xì)菌信息及比對(duì)相似度如表2所示。其中，分離得到的海桿菌和噬冷菌等均為藻際細(xì)胞的主要細(xì)菌群落。因此，分離得到的細(xì)菌與測(cè)序分析獲得的結(jié)果基本一致，一定程度上驗(yàn)證了測(cè)序結(jié)果的可靠性。

表2 從湛江等鞭金藻野生株(IZ)和湛江等鞭金藻誘變株(IM)分離的藻際細(xì)菌信息Table 2 The information of bacteria isolated from wildstrain I.zhangjiang(IZ) and mutant strain I.zhangjiangensis(IM)

3 討論

通過(guò)比較湛江等鞭金藻野生型和誘變型藻株在25℃和35℃的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)兩株藻在25℃條件下的生長(zhǎng)差異并不明顯；但在35℃條件下，誘變株的生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于野生型。已有很多研究發(fā)現(xiàn)藻際微生物對(duì)微藻至關(guān)重要[14，28-29]，然而鮮有研究解析其是否與微藻耐高溫能力存在關(guān)聯(lián)。因此，本試驗(yàn)以湛江等鞭金藻及其耐高溫誘變株為研究對(duì)象，運(yùn)用16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)比較了這兩株藻在正常培養(yǎng)溫度(25℃)和高溫條件(35℃)下藻際細(xì)菌組成的差異，解析了藻際細(xì)菌組成與耐高溫能力的關(guān)系。

兩株湛江等鞭金藻在不同溫度條件下藻際細(xì)菌門水平組成上較為相似，其中主要優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門和擬桿菌門，其次是擬桿菌門和厚壁菌門。目前已有研究發(fā)現(xiàn)變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門是藻際細(xì)菌群的重要菌群組成[26，30-32]。另外，對(duì)比不同溫度下的屬水平細(xì)菌組成發(fā)現(xiàn)，海洋柄菌和Glycocaulis的相對(duì)豐度在35℃下普遍高于相對(duì)應(yīng)的25℃。這在微小亞歷山大藻中也有同樣的發(fā)現(xiàn)，溫度升高對(duì)其藻際細(xì)菌群落改變的主要表現(xiàn)之一就是海洋柄菌的細(xì)菌豐度提升了17%[33]；Abraham 等[34]研究發(fā)現(xiàn)一種與海洋柄菌親緣關(guān)系最接近、適宜30℃的耐高溫Glycocaulis細(xì)菌，這也驗(yàn)證了本研究在高溫下發(fā)現(xiàn)的屬水平藻際細(xì)菌群落差異。另外，本研究發(fā)現(xiàn)上述兩個(gè)差異屬在上一級(jí)的分類單位中屬于同一科(生絲單胞菌科，Hyphomonadacea)，而近年來(lái)全球變暖的情況導(dǎo)致了該科水平細(xì)菌在海洋中的豐度上升[35]。藻際細(xì)菌組成在屬水平上差異較大，主要是IM35L 組中噬冷菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度明顯高于其他三組。因此溫度的升高會(huì)造成水體中藻際微生物群落的變化，結(jié)合兩株藻在25℃和35℃下的生長(zhǎng)情況來(lái)看，噬冷菌屬細(xì)菌的相對(duì)豐度差異可能是湛江等鞭金藻誘變株在35℃下生長(zhǎng)更好的原因之一。

為進(jìn)一步分析35℃下兩株藻間生長(zhǎng)差異，明確具有顯著性差異的細(xì)菌物種，采用MetaStat 方法對(duì)所有組間差異物種在種水平上進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除未知種外在組間具有顯著性差異豐度的細(xì)菌共計(jì)兩種。其中變形菌門紅螺菌目細(xì)菌阿爾法變形菌DG1252 在25℃下野生株組和誘變株組的豐度無(wú)明顯差異，但在35℃下誘變株組的豐度顯著高于野生株組。目前已有研究表明該目的模式物種深海紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)在71℃下仍能進(jìn)行光合作用，且該現(xiàn)象在同一門水平都具有廣泛的適用性[36]。因此推測(cè)阿爾法變形菌DG1252 在35℃下可能是提高湛江等鞭金藻誘變株高溫耐受性的重要菌種。但該微生物在高溫下能否增強(qiáng)藻類對(duì)高溫的耐受性還有待深入驗(yàn)證。

本研究對(duì)兩株藻的藻際細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步分離與鑒定，分別從IZ 和IM 中分離鑒定了4 株和5 株藻際細(xì)菌，其中包括2 株噬冷菌屬細(xì)菌，但未分離得到阿爾法變形菌DG1252，這可能是由于本研究采取單一的培養(yǎng)基分離藻際細(xì)菌具有一定的局限性，造成一些重要細(xì)菌未分離到。因此，為進(jìn)一步解析這些細(xì)菌與湛江等鞭金藻耐高溫性狀的關(guān)系，需要增加分離細(xì)菌的培養(yǎng)基類型來(lái)鑒定分離更多藻際細(xì)菌；此外，將兩株湛江等鞭金藻藻株先進(jìn)行無(wú)菌純化處理，再將除菌后的藻株與分離得到的噬冷菌屬菌株進(jìn)行共培養(yǎng)試驗(yàn)，有助于進(jìn)一步驗(yàn)證其與湛江等鞭金藻耐高溫性狀的關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究基于16S rDNA 擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，分析了湛江等鞭金藻野生株和誘變株藻際細(xì)菌多樣性及其耐高溫性狀的聯(lián)系。結(jié)果表明，25℃下兩株藻的藻際細(xì)菌群落差異小，但在35℃高溫下培養(yǎng)的兩株藻藻際細(xì)菌群落組成差異明顯。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，噬冷菌屬細(xì)菌和阿爾法變形菌DG1252 在兩株藻中的相對(duì)豐度在25℃下無(wú)顯著差異，但在35℃下誘變株相對(duì)豐度顯著高于野生株，兩者可能與湛江等鞭金藻誘變株高溫耐受性相關(guān)。此外，本研究分離并鑒定了包括噬冷菌屬細(xì)菌在內(nèi)的9 株藻際細(xì)菌，但未能分離阿爾法變形菌DG1252。后續(xù)可對(duì)藻際細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定并進(jìn)行共培養(yǎng)試驗(yàn)，以驗(yàn)證其與湛江等鞭金藻耐高溫性狀的關(guān)系。本研究為金藻高溫抗逆性和藻際細(xì)菌多樣性的關(guān)系探索提供了新方向，有助于夏季高溫條件下水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程貝類餌料微藻的培育和擴(kuò)繁。