胡亮，方磊，李瑞蓮，王湘波，周明

湖南省藥品檢驗研究院，湖南藥用輔料檢驗檢測中心，湖南省藥品質量評價工程技術研究中心，湖南 長沙 410001

土牛膝最早記載于《本草綱目》，指各地野生的牛膝，為莧科植物牛膝Achyranthes bidentataB1.的干燥根，其功效為“活血散瘀、祛風利尿，墜胎”［1］；肖步丹《嶺南采藥錄》［2］中記載土牛膝的來源之一為粗毛牛膝Achyranthes aspera L.的根。土牛膝作為西南地區(qū)瑤族和土家族常用的民族藥，應用十分廣泛，但未有國家統(tǒng)一的藥材標準，其中《湖南省中藥材標準》2009 年版、《貴州省中藥材標準》2003 年版收載的植物基原為莧科植物粗毛牛膝AchyranthesasperaL.的干燥根及根莖；《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》1980 年版收載了3 個基原，分別為粗毛牛膝、野生牛膝和柳葉牛膝；現(xiàn)行其余質量標準收載基原均為野生牛膝［3-4］。土牛膝的現(xiàn)行質量標準包括性狀、顯微鑒別和薄層色譜鑒別項目，通過品種考證、藥用資源分布調(diào)查發(fā)現(xiàn)，3 種土牛膝藥材外觀形態(tài)較相似，不易區(qū)分，存在不同基原混用的情況。

近年來，隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，植物DNA 條形碼被大量應用于不同基原藥材的鑒定，陳士林等［5］首次提出將ITS2 序列作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列。DNA 條形碼鑒定技術在中藥藥材鑒定中具有不受個體形態(tài)特征、藥用部位、鑒定經(jīng)驗等限制的優(yōu)點，克服了傳統(tǒng)鑒定方法的諸多缺陷［6-10］。其中植物核糖體DNA 內(nèi)轉錄間隔區(qū)（rDNA/ITS 區(qū)）序列進化速率快，可以提供豐富的變異位點和信息位點［11］。本研究首次應用ITS 和MatK 條形碼對3 種植物基原土牛膝藥材及其混偽品（川牛膝、廣東土牛膝）進行鑒定研究，為土牛膝的快速準確鑒定提供新的技術手段。

1 儀器與試藥

植物基因組DNA 提取試劑盒（Plant Genomic DNA kit，TIANGEN）；2×Taq Master Mix 緩沖液（GK8006，GENEray）；ExRed（ZS203-1，庒盟生物）；瓊脂糖（50002，Lonza）；引物（上海捷瑞生物工程有限公司合成），ITS 引物（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'），MatK引物（MatKF：5'-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3'；MatKR：5'-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3'）。

PCR 儀：ABI VERITI；分 析 天 平：Mettler AB135-S；MM400 球磨儀：德國Retsch 公司；純水儀：美國Millipore 公司；Nano Value 微量紫外分光光度計；電泳儀：EPS-301，美國Amersham 公司；全自動凝膠成像系統(tǒng)：英國Syngene 公司。

2 材料

本次研究共收集30 份樣本，包括5 個物種。其中實驗樣本24 份（表1），包含粗毛牛膝、野生牛膝、柳葉牛膝、川牛膝和廣東土牛膝，實驗材料由湖南省野生動植物司法鑒定中心進行鑒定。其余4 條ITS和2 條MatK 研究序列來自GenBank，ITS 序列包含野生牛膝2 條（登錄號KX055976、KX055977），柳葉牛膝1 條（登錄號MG730614），川牛膝1 條（登錄號KC898550）；MatK 序列包含野生牛膝2 條（登錄號MH659904、MH658983）。

表1 土牛膝及其混偽品樣品信息

3 方法

3.1 DNA 提取

研究樣品經(jīng)75%乙醇擦拭表面，稱取50 mg，在MM400 球磨儀（德國Retsch）上進行研磨，用天根植物基因組DNA 提取試劑盒提取DNA。

3.2 PCR 擴增和測序

PCR 反應體積為20 μL，使用ITS 和MatK 序列的通用引物對樣品DNA 進行擴增，其反應條件為：95 ℃變性5 min，再進行35 個循環(huán)（95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1min），最后72 ℃延伸7 min。反應體系為2×Taq PCR MasterMix 10 μL，正反向引物（2.5 μmol/L）各0.4 μL，模板DNA 1 μL，其余用滅菌超純水補至20 μL。通過ABI3730XL 測序儀對純化后的PCR 產(chǎn)物進行雙向測序。

3.3 數(shù)據(jù)分析

應用軟件CodonCode Aligner V6.0 對序列峰圖進行校對拼接，去除引物區(qū)及低質量序列，獲得ITS序列和MatK 序列。利用軟件MEGA 6.0 進行種內(nèi)種間Kimura 2-parameter（K2P）遺傳距離分析，用NJ（鄰接）法構建系統(tǒng)聚類樹對土牛膝及其混偽品進行鑒定分析。

4 結果與分析

4.1 土牛膝及其混偽品藥材DNA 提取與PCR 擴增

研究樣品采用植物基因組DNA 提取試劑盒并做適當調(diào)整，提取的樣本DNA 使用Nano Value 微量紫外分光光度計進行純度測定。通過ITS 和MatK引物進行PCR 擴增，電泳條帶清晰，其中ITS 擴增片段約750 bp，為單一條帶；MatK 擴增片段約780 bp，見圖1。

圖1 土牛膝藥材及其混偽品電泳圖

4.2 土牛膝及混偽品藥材ITS 序列種內(nèi)及種間變異分析

使用MEGA 6.0 軟件對樣品ITS 序列進行變異位點分析，粗毛牛膝與柳葉牛膝、野生牛膝存在28～32 個變異位點，變異率為4.25%～4.86%；粗毛牛膝和柳葉牛膝均只有一個單倍型；野生牛膝有2 個單倍型，2 個單倍型之間有1 個堿基差異，為418 位的C-A 取代；粗毛牛膝與川牛膝存在75 個變異位點，部分堿基有缺失，川牛膝只有一個單倍型；粗毛牛膝與廣東土牛膝存在150 多個變異位點，部分堿基有缺失，廣東土牛膝存在一個單倍型，不同基原土牛膝與混偽品川牛膝、廣東土牛膝堿基差異較大，易于區(qū)分。

粗毛牛膝與柳葉牛膝的種間最大K2P 為0.051，與野生牛膝的種間最大K2P 為0.044，柳葉牛膝和野生牛膝的種間最大K2P 為0.010；3 種植物基原的土牛膝（粗毛牛膝、野生牛膝和柳葉牛膝）與川牛膝的種間K2P 范圍為0.111～0.121、與廣東土牛膝的種間K2P 范圍為0.415～0.444。土牛膝各基原間種內(nèi)最大K2P 小于種間最小K2P，有利于不同基原土牛膝的區(qū)分，同時與混偽品川牛膝、廣東土牛膝K2P 較遠，區(qū)分明顯。

4.3 土牛膝藥材Matk 序列種內(nèi)及種間變異分析

用MEGA 6.0 軟件對樣品MatK 序列進行變異位點分析，粗毛牛膝與柳葉牛膝、野生牛膝存在5個變異位點，變異率為0.61%；粗毛牛膝和柳葉牛膝均只有一個單倍型，野生牛膝有2 個單倍型，2個單倍型之間有2 個堿基差異，為232 位的G-C 取代和621 位的C-T 取代。粗毛牛膝與野生牛膝、柳葉牛膝的種間平均K2P 均為0.006，柳葉牛膝和野生牛膝的種間平均K2P 為0.001；不同基原土牛膝之間種間K2P 較小，不利于物種的鑒別。

4.4 土牛膝藥材及其混偽品NJ 樹鑒定

從基于ITS 序列建立的聚類樹種可看出，不同植物基原粗毛牛膝、野生牛膝和柳葉牛膝聚為獨立的一支，且支持率高，并呈現(xiàn)較好的單系性；混偽品川牛膝和廣東土牛膝聚為獨立的一支，呈現(xiàn)較好的單系性，與不同基原土牛膝能夠進行有效區(qū)分，見圖2。

圖2 基于ITS序列建立土牛膝與其混偽品的NJ樹圖

基于MatK 序列建立的聚類樹種可看出，粗毛牛膝聚為獨立的一支，呈現(xiàn)較好的單系性，野生牛膝和柳葉牛膝均未單獨聚為一支，種間差異較小，未能有效進行區(qū)分，見圖3。

圖3 基于MatK序列建立土牛膝與其混偽品的NJ樹圖

5 討論

土牛膝作為西南地區(qū)瑤族和土家族常用的民族藥，應用十分廣泛?；诂F(xiàn)有樣品的ITS 序列變異分析表明，粗毛牛膝、柳葉牛膝暫未在現(xiàn)有樣品中發(fā)現(xiàn)種內(nèi)變異，后續(xù)需進一步擴大樣品量；野生牛膝種內(nèi)變異較小，種內(nèi)最大K2P 為0.006。土牛膝藥材及其混偽品ITS 擴增序列NJ 樹圖分析表明，粗毛牛膝、野生牛膝和柳葉牛膝可相互區(qū)分，土牛膝3 種基原與其混偽品川牛膝、廣東土牛膝區(qū)別明顯；MatK 擴增序列NJ 樹圖分析表明，粗毛牛膝單獨聚為一支，但與野生牛膝和柳葉牛膝未能進行有效區(qū)分。因此，ITS 作為常用的DNA 條形碼，不僅可以鑒定土牛膝3 種基原，而且可以有效區(qū)分其常見混偽品川牛膝和廣東土牛膝。