劉潔儀，張 睿，夏 冬，李 镕，李曉雯，陳姿旭，魏 青，趙志強(qiáng)，*，何 云，*

(1.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，廣東廣州 510080；2.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣東 廣州 510080)

近年來，霧霾天氣頻發(fā)，空氣污染問題愈發(fā)嚴(yán)重，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)影響人群健康的重大公共衛(wèi)生事件之一。大氣細(xì)顆粒物(fine particulate matter，PM)是造成空氣污染的主要成分之一，其粒徑小、比表面積大，易吸附空氣中其他有害物質(zhì)，從而對(duì)人體健康產(chǎn)生更大的威脅。PM可以隨著呼吸道進(jìn)入肺泡，通過氣血屏障進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，造成血管內(nèi)皮功能障礙從而誘發(fā)心血管疾病，也可以通過損傷大腦血管內(nèi)皮之間的緊密連接，破壞血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的完整性并進(jìn)入大腦，同時(shí)還有其他炎癥因子從破壞的BBB 進(jìn)入腦部，從而誘導(dǎo)阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的發(fā)生。大量證據(jù)顯示，短期或長期暴露于PM會(huì)導(dǎo)致心血管不良事件如心肌梗死、心律失常、動(dòng)脈粥樣硬化等事件的發(fā)生率增加，從而導(dǎo)致心血管疾病死亡率增加。此外，有研究表明長期暴露于高濃度PM會(huì)導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)損傷，認(rèn)知功能下降，AD 相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)升高，證明 PM與 AD 的發(fā)生有密切聯(lián)系。

PM是一種極其不均勻的混合物，包含多種成分，如有機(jī)碳化合物、元素碳、重金屬等，然而其中某種成分或某幾種成分聯(lián)合暴露對(duì)于心血管疾病或AD 的毒性機(jī)制尚不明確，因此有必要對(duì)PM中不同組分進(jìn)行研究。納米炭黑顆粒是空氣污染物中超細(xì)粒子的重要組成，主要來自燃料不完全燃燒時(shí)產(chǎn)生的煙灰，微米級(jí)的二氧化硅塵土顆粒也是大氣顆粒物的重要組成部分，現(xiàn)有證據(jù)表明，炭黑暴露會(huì)損害心臟功能，引起心血管疾病的發(fā)生，長期暴露于二氧化硅也可以增加心血管疾病的死亡率。同時(shí)有研究表明，超細(xì)炭黑顆?？梢砸鸺?xì)胞氧化應(yīng)激，使細(xì)胞發(fā)生阿爾茨海默樣改變。納米炭黑顆粒與塵土顆粒都可以作為載體吸附其他重金屬污染物，是大氣污染研究中的理想模型粒子。此外，重金屬也是PM中的重要組成部分，鉛是PM中的富集金屬，豐度較高，而砷、鎘的含量雖然較低，但是二者的毒性作用比較大，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)歸為1A類致癌物。有研究證實(shí)，鉛、砷、鎘都可以通過氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)心血管疾病發(fā)生；也可以通過協(xié)同作用增加淀粉樣蛋白形成，促進(jìn)AD 發(fā)生。AD 的發(fā)生發(fā)展與血管因素密切相關(guān)，往往在AD 早期就會(huì)出現(xiàn)腦血管損傷及血腦屏障功能障礙，包括血腦屏障滲透性增加，微血流的改變，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙等，PM會(huì)損害血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管屏障作用，對(duì)AD 的發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)是體外研究血管功能最常用的一種細(xì)胞模型。因此，本研究選用HUVECs 作為研究對(duì)象，以炭黑、塵土顆粒及重金屬鉛、砷、鎘作為受試物，探討PM中各個(gè)組分以及不同組分聯(lián)合暴露對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用大小，為后續(xù)分子機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞

永生化的HUVECs 由本實(shí)驗(yàn)室分離保存，培養(yǎng)于20%胎牛血清的M199 完全培養(yǎng)基中，置于CO體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱，常規(guī)胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.1.2 試劑

M199 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶、青霉素&鏈霉素雙聯(lián)抗生素購自美國Gibco公司；二甲基亞砜購自美國Sigma 公司；三水合醋酸鉛、亞砷酸鈉、無水氯化鎘購自廣州艾斯金公司；納米炭黑顆粒(粒徑14 nm，下稱炭黑)購自德國Degussa AG 公司，亞利桑那測試塵土顆粒(粒徑0～3 μm，主要成分為二氧化硅，下稱塵土)購自美國PTI公司；CCK-8檢測試劑盒購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司。

1.1.3 儀器

CO細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo 公司，倒置顯微鏡購自德國Leica 公司，分析天平購自德國Sartorius 公司，超聲振蕩清洗器購自昆山市超聲有限公司，渦旋振蕩器購自美國SCILOGEX 公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Elx-800型)購自美國Bio-Tek公司。

1.2 方 法

1.2.1 鉛、砷、鎘染毒液的配制

將0.076 g 三水合醋酸鉛粉末溶于10 mL 超純水中，配制成20 mmol/L醋酸鉛儲(chǔ)備液，混勻，0.22 μm 濾器過濾除菌，4 ℃保存；將0.013 g 亞砷酸鈉粉末溶于10 mL 超純水中，配制成10 mmol/L 亞砷酸鈉儲(chǔ)備液，混勻，0.22 μm 濾器過濾除菌，4 ℃保存；將0.036 g 氯化鎘結(jié)晶溶于10 mL 超純水中，配制成20 mmol/L 氯化鎘儲(chǔ)備液，混勻，0.22 μm 濾器過濾除菌，4 ℃保存。染毒前用含2%胎牛血清的M199完全培養(yǎng)基按實(shí)驗(yàn)需求將上述儲(chǔ)備液稀釋成相應(yīng)的濃度，立即用于細(xì)胞染毒。

1.2.2 炭黑顆粒和塵土顆粒懸浮液配制

實(shí)驗(yàn)中使用分析天平稱取0.025 g 納米炭黑顆粒加入50 mL 超純水中，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 的儲(chǔ)備液，超聲15 min后高壓滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆?；?shí)驗(yàn)中使用分析天平稱取2.5 g 塵土顆粒加入50 mL 超純水中，配制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL 的儲(chǔ)備液，超聲15 min 后高壓滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆?。染毒前取炭黑顆粒和塵土顆粒儲(chǔ)備液渦旋振蕩混勻，用含2%胎牛血清的M199完全培養(yǎng)基按實(shí)驗(yàn)需求稀釋成相應(yīng)的濃度，立即用于細(xì)胞染毒。

1.2.3 細(xì)胞生長曲線及倍增時(shí)間測定

待狀態(tài)良好的HUVECs 生長至匯合度為80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化并制成單細(xì)胞懸液，按一定倍數(shù)稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果按1×10個(gè)/mL接種于24孔板，每孔1 mL，混勻，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后每隔2 d 更換新鮮培養(yǎng)基。從第2 天開始，每隔24 h取出孔板，隨機(jī)選擇3個(gè)孔，用胰酶消化并制備單細(xì)胞懸液，計(jì)算每孔細(xì)胞數(shù)量，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d，制成細(xì)胞生長曲線。細(xì)胞計(jì)數(shù)公式為：

式中，

t

表示培養(yǎng)時(shí)間(h)，

n

表示首次計(jì)數(shù)獲得的細(xì)胞數(shù)，

n

表示培養(yǎng)

t

時(shí)間后(一般情況下是細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長期的終點(diǎn)時(shí))的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.4 試驗(yàn)分組和處理

分別用炭黑、塵土、醋酸鉛、亞砷酸鈉、氯化鎘對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒。進(jìn)行劑量研究時(shí)，炭黑的濃度分別為0、5、10、20、40、80、160 μg/mL，塵土的濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80、160 μg/mL，醋酸鉛的濃度分別為0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μmol/L，亞砷酸鈉的濃度分別為0、5、10、20、40、80、160 μmol/L，氯化鎘的濃度分別為0、5、10、20、40、80、160 μmol/L。染毒時(shí)間均為24 h。進(jìn)行聯(lián)合染毒時(shí)，選擇細(xì)胞存活率為80%的劑量進(jìn)行試驗(yàn)。故炭黑選用的濃度為5 μg/mL，分別與50 μmol/L 醋酸鉛、5 μmol/L 亞砷酸鈉、5 μmol/L 氯化鎘進(jìn)行聯(lián)合染毒；塵土選用的濃度為20 μg/mL，分別與 50 μmol/L 醋酸鉛、5 μmol/L 亞砷酸鈉、5 μmol/L氯化鎘進(jìn)行聯(lián)合染毒。同時(shí)根據(jù)在PM中各組分的實(shí)際質(zhì)量占比，選取炭黑的濃度為5 μg/mL，按

m

∶

m

=1∶50，

m

∶

m

=1∶100，

m

∶

m

=1∶500 進(jìn)行兩者聯(lián)合染毒，以及按

m

∶

m

∶

m

∶

m

=10∶5∶1∶500比例進(jìn)行四者聯(lián)合染毒。選取塵土的濃度為20 μg/mL，按

m

∶

m

=1∶50，

m

∶

m

=1∶100，

m

∶

m

=1∶500 進(jìn)行兩者聯(lián)合染毒，以及按

m

∶

m

∶

m

∶

m

=10∶5∶1∶500比例進(jìn)行四者聯(lián)合染毒。染毒時(shí)間為24 h。

1.2.5 CCK-8 法檢測受試物對(duì)細(xì)胞存活率的影響

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，按每孔1×10個(gè)接種于96 孔板中，加入M199 完全培養(yǎng)基，放置于37 ℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長至匯合度為70%～80%時(shí)，給予上述不同受試物的不同濃度進(jìn)行染毒，染毒24 h后，吸掉染毒液，用PBS沖洗2 遍，每孔加入 90 μL 的培養(yǎng)基和 10 μL 的 CCK-8 溶液，放入37 ℃、5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度

D

(450)值和

D

(630)值(計(jì)算時(shí)先扣除參比波長630 nm 處的吸光度值)，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行孔，另設(shè)陰性對(duì)照和空白調(diào)零孔。采用以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率和抑制率，并計(jì)算每種受試物對(duì)HUVECs 的半數(shù)抑制濃度(median inhibition concentration，IC)。

2 結(jié) 果

2.1 HUVECs 生長曲線繪制及其細(xì)胞群體倍增時(shí)間的測定

以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制HUVECs 生長曲線，如圖1 所示。從圖中可以看出，細(xì)胞在接種后最初2 d 處于生長潛伏期，在第3 天進(jìn)入生長對(duì)數(shù)期，生長增殖迅速，倍增時(shí)間約為32 h，培養(yǎng)至第6 天細(xì)胞數(shù)達(dá)到峰值，未出現(xiàn)明顯的生長平臺(tái)期，第7天細(xì)胞數(shù)減少，進(jìn)入衰減期。

圖1 HUVECs生長曲線

2.2 不同受試物單獨(dú)染毒時(shí)對(duì)細(xì)胞存活率的影響及IC50的測定

2.2.1 納米炭黑顆粒對(duì)HUVECs 存活的影響

用不同濃度0、5、10、20、40、80、160 μg/mL 炭黑處理細(xì)胞24 h 后，使用CCK-8 試劑盒檢測細(xì)胞存活抑制情況。結(jié)果如圖2A 所示，與空白對(duì)照組相比，不同濃度組細(xì)胞存活率均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)，且隨著染毒濃度升高，細(xì)胞存活率也呈逐漸降低的趨勢(

F

=224.98，

P

＜0.05)，說明炭黑會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒作用，具有細(xì)胞毒性效應(yīng)，計(jì)算得出炭黑對(duì)HUVECs的IC為16 μg/mL。

2.2.2 塵土顆粒對(duì)HUVECs 存活的影響

用不同濃度0、2.5、5、10、20、40、80、160 μg/mL塵土處理細(xì)胞24 h 后，使用CCK-8 試劑盒檢測細(xì)胞存活抑制情況。結(jié)果如圖2B所示，隨著染毒濃度的增加，細(xì)胞存活率總體呈下降趨勢(

F

=307.33，

P

＜0.05)。與對(duì)照組相比，塵土在2.5 μg/mL 濃度時(shí)，細(xì)胞存活率為(102.34±1.01)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＞0.05)；細(xì)胞存活率自20 μg/mL 組開始明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)。而且由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知當(dāng)塵土濃度低于20 μg/mL時(shí)，處理組相比于對(duì)照組HUVECs的存活率仍保持在80%左右，提示塵土在低濃度(2.5、5、10、20 μg/mL)對(duì)細(xì)胞存活率的影響較小，即產(chǎn)生的細(xì)胞毒性較低；當(dāng)塵土濃度逐漸升高，高于20 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞存活率的影響也逐漸增大，具有一定的細(xì)胞毒性效應(yīng)，計(jì)算得出塵土對(duì)HUVECs 的IC為110 μg/mL。

2.2.3 不同濃度醋酸鉛對(duì)HUVECs 存活的影響

用不同濃度 0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μmol/L 醋酸鉛處理細(xì)胞24 h 后，結(jié)果如圖2C 所示，與對(duì)照組相比，醋酸鉛濃度為6.25 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率為(108.88±7.05)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＞0.05)；濃度為12.5 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)。醋酸鉛濃度為25、50 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞未出現(xiàn)明顯死亡；而細(xì)胞存活率自100 μmol/L組開始隨著染毒濃度升高而逐漸下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)?？傮w來講，隨著鉛染毒濃度的升高，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(

F

=552.38，

P

＜0.05)，計(jì)算得出醋酸鉛對(duì)HUVECs細(xì)胞的IC為184 μmol/L。

2.2.4 不同濃度亞砷酸鈉對(duì)HUVECs 存活的影響

用不同濃度0、5、10、20、40、80、160 μmol/L亞砷酸鈉處理細(xì)胞24 h 后，結(jié)果如圖2D 所示，細(xì)胞存活率呈濃度依賴式降低。與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率自5 μmol/L 組開始明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)。說明亞砷酸鈉會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒作用，且細(xì)胞存活率隨著染毒濃度升高而呈現(xiàn)下降趨勢(

F

=237.98，

P

＜0.05)，計(jì)算得出亞砷酸鈉對(duì) HUVECs 的IC為15 μmol/L。

2.2.5 不同濃度氯化鎘對(duì)HUVECs 存活的影響

用不同濃度0、5、10、20、40、80、160 μmol/L亞砷酸鈉處理細(xì)胞24 h 后，結(jié)果如圖2E 所示，結(jié)果與亞砷酸鈉一致，與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)，且隨著氯化鎘染毒濃度的升高，細(xì)胞存活率有下降的趨勢(

F

=276.15，

P

＜0.05)。說明氯化鎘同樣具有細(xì)胞毒性，計(jì)算得出氯化鎘對(duì)HUVECs的IC為14 μmol/L。

圖2 不同受試物染毒24 h對(duì)HUVECs存活率的影響

2.3 不同受試物聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞存活率的影響

2.3.1 炭黑顆粒與鉛、砷、鎘聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞存活率的影響

根據(jù)2.2 的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)選用細(xì)胞存活率為80%的染毒濃度，炭黑為5 μg/mL，分別與50 μmol/L醋酸鉛、5 μmol/L亞砷酸鈉和5 μmol/L氯化鎘進(jìn)行聯(lián)合染毒。處理細(xì)胞24 h 后，結(jié)果如圖3A 所示，與對(duì)照組相比，炭黑單獨(dú)染毒與聯(lián)合染毒時(shí)，細(xì)胞存活率均有所下降(

P

＜0.05)，且炭黑與鉛、砷、鎘聯(lián)合作用時(shí)細(xì)胞存活率下降幅度比炭黑單獨(dú)染毒時(shí)大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)。此外，根據(jù)PM中各組分的實(shí)際質(zhì)量占比來確定聯(lián)合染毒濃度。PM中元素碳(elemental carbon，EC)的質(zhì)量占比為3%～10%，鉛的質(zhì)量占比為0.05%～0.20%，砷的質(zhì)量占比為0.01%～0.05%，鎘的質(zhì)量占比為0.005%～0.01%。故炭黑的濃度仍為5 μg/mL，根據(jù)以上比例，確定鉛與炭黑的質(zhì)量比為1∶50(鉛的濃度為0.5 μmol/L)，砷與炭黑的質(zhì)量比為1∶100(砷的濃度為0.67 μmol/L)，鎘與炭黑的質(zhì)量比為1∶500(鎘的濃度為0.1 μmol/L)，鉛、砷、鎘混合與炭黑的質(zhì)量比為

m

∶

m

∶

m

∶

m

=10∶5∶1∶500。處理細(xì)胞24 h后，結(jié)果如圖3B所示，與對(duì)照組相比，單獨(dú)染毒與聯(lián)合染毒時(shí)細(xì)胞存活率均下降(

P

＜0.05)，炭黑與鉛(

m

∶

m

=50∶1)聯(lián)合染毒組和炭黑與砷(

m

∶

m

=100∶1)聯(lián)合染毒組細(xì)胞存活率與炭黑單獨(dú)染毒組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＞0.05)，炭黑與鎘(

m

∶

m

=500∶1)聯(lián)合染毒組細(xì)胞存活率下降幅度比炭黑單獨(dú)染毒組大，炭黑與鉛砷鎘聯(lián)合染毒組(

m

∶

m

∶

m

∶

m

=10∶5∶1∶500)細(xì)胞存活率大幅降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)。

圖3 炭黑和醋酸鉛、亞砷酸鈉、氯化鎘聯(lián)合染毒24 h對(duì)HUVECs存活率的影響

2.3.2 塵土顆粒與鉛、砷、鎘聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞存活率的影響

根據(jù)2.2 的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)選用細(xì)胞存活率為80%的染毒濃度，塵土染毒濃度為20 μg/mL，分別與50 μmol/L 醋酸鉛、5 μmol/L 亞砷酸鈉和5 μmol/L 氯化鎘進(jìn)行聯(lián)合染毒。處理細(xì)胞24 h 后，結(jié)果如圖4A所示，與對(duì)照組相比，塵土單獨(dú)染毒與聯(lián)合染毒時(shí)，細(xì)胞存活率均有所下降(

P

＜0.05)，且塵土與鉛、砷、鎘聯(lián)合作用時(shí)細(xì)胞存活率下降幅度比塵土單獨(dú)染毒時(shí)大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)。此外，根據(jù)PM中各組分的實(shí)際占比來確定聯(lián)合染毒劑量。塵土染毒濃度為20 μg/mL，鉛與塵土的質(zhì)量比為1∶50(鉛的濃度為2 μmol/L)，砷與塵土的質(zhì)量比為1∶100(砷的濃度為2.67 μmol/L)，鎘與塵土的質(zhì)量比為1∶500(鎘的濃度為0.35 μmol/L)，鉛砷鎘混合與塵土的質(zhì)量比為

m

∶

m

∶

m

∶

m

=10∶5∶1∶500。處理細(xì)胞24 h后，結(jié)果如圖4B所示，與對(duì)照組相比，塵土單獨(dú)染毒與聯(lián)合染毒時(shí)細(xì)胞存活率均下降(

P

＜0.05)，塵土與鉛(

m

∶

m

=50∶1)聯(lián)合染毒組和塵土與鎘(

m

∶

m

=500∶1)聯(lián)合染毒組細(xì)胞存活率與塵土組相比無顯著差異(

P

＞0.05)，塵土與砷(

m

∶

m

=100∶1)聯(lián)合染毒組細(xì)胞存活率下降幅度比塵土組大，塵土與鉛砷鎘聯(lián)合染毒組(

m

∶

m

∶

m

∶

m

=10∶5∶1∶500)細(xì)胞存活率大幅降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)。

圖4 塵土和醋酸鉛、亞砷酸鈉、氯化鎘聯(lián)合染毒24 h對(duì)HUVECs存活率的影響

2.4 交互作用分析

2.4.1 炭黑與鉛、砷、鎘交互作用對(duì)細(xì)胞存活率的影響

在炭黑與醋酸鉛、亞砷酸鈉、氯化鎘交互作用的研究中，采用2×2 析因設(shè)計(jì)進(jìn)行分析。結(jié)果如表1 所示，炭黑與醋酸鉛之間無交互作用(

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＞0.05)，炭黑與亞砷酸鈉、炭黑與氯化鎘之間均具有交互作用(

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＜0.05)。此外，炭黑、亞砷酸鈉、氯化鎘單獨(dú)染毒時(shí)，細(xì)胞存活率分別為(84.90±2.34)%、(68.34±2.65)%、(87.26±2.40)%，而炭黑與亞砷酸鈉聯(lián)合染毒時(shí)細(xì)胞存活率為(47.85±1.37)%，炭黑與氯化鎘聯(lián)合染毒時(shí)細(xì)胞存活率為(45.01±5.83)%，聯(lián)合染毒時(shí)細(xì)胞存活率顯著低于單獨(dú)染毒時(shí)(

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＜0.05)，說明炭黑與亞砷酸鈉、炭黑與氯化鎘聯(lián)合染毒時(shí)對(duì)細(xì)胞毒性作用增強(qiáng)，二者之間表現(xiàn)為協(xié)同作用。

表1 炭黑與鉛、砷、鎘聯(lián)合染毒析因設(shè)計(jì)方差分析表

2.4.2 塵土與鉛砷鎘交互作用對(duì)細(xì)胞存活率的影響

在塵土與醋酸鉛、亞砷酸鈉、氯化鎘交互作用的研究中，采用2×2 析因設(shè)計(jì)進(jìn)行分析。結(jié)果如表2 所示，塵土與醋酸鉛、塵土與亞砷酸鈉、塵土與氯化鎘之間均無交互作用(

P

＞0.05)。

3 討 論

當(dāng)前空氣PM污染仍然是威脅人類健康的主要因素之一，流行病學(xué)研究報(bào)告表明，環(huán)境PM暴露與許多心血管疾病以及神經(jīng)退行性病變?nèi)鏏D 密切相關(guān)。PM的化學(xué)組成十分復(fù)雜，其中炭黑和塵土顆粒是PM中的重要核心粒子，而且也被作為模型顆粒物而廣泛應(yīng)用于大氣研究。重金屬元素也是PM的重要組成部分，一般占大氣顆粒物的0.3%～5.0%，雖然含量不高，但是由于重金屬不可降解性、生物富集性等特點(diǎn)，仍然會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生較大危害。有學(xué)者對(duì)我國部分城市的PM中重金屬含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)各元素平均濃度從高到低的順序?yàn)?Zn＞Pb＞Cu＞Cr＞Ni＞As＞Cd。由此可見，Pb在PM中的含量較高，而As和Cd 的含量較低，但是這兩種元素的毒性作用較大，已經(jīng)被IARC 歸類為1A 類致癌物。因此，本研究從PM不同組分入手，探討顆粒物質(zhì)和重金屬元素對(duì)HUVECs的單獨(dú)毒性作用及聯(lián)合毒性作用。

表2 塵土與鉛、砷、鎘聯(lián)合染毒析因設(shè)計(jì)方差分析表

目前來說，檢測不同受試物對(duì)細(xì)胞的毒性大小，通常用的幾種方法有噻唑藍(lán)(methylthiazolydiphenyltetrazolium bromide，MTT)比色法和 CCK-8 法。MTT比色法具有簡單、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，但是由于其還原性甲臜產(chǎn)物不溶于水，需要用二甲基亞砜(DMSO)溶解后才能進(jìn)行檢測，增加了操作流程，也使結(jié)果準(zhǔn)確性受到一定影響。而CCK-8法是近年來一種新的檢測方法，它利用水溶性四唑鹽WST-8在電子載體存在的情況下能夠被還原成水溶性的甲臜染料，可直接進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)誤差小，是一種高靈敏度的檢測方法。此外，如果樣品中有影響測定的物質(zhì)如炭黑和塵土顆粒，可以通過設(shè)定參比波長(600 nm 以上)，將其吸光度值扣除，以避免由于樣品渾濁所帶來的吸收。也有研究者將兩種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)比，認(rèn)為CCK-8法更為簡便、靈敏，明顯優(yōu)于MTT法。

研究發(fā)現(xiàn)，用不同受試物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)染毒時(shí)，細(xì)胞存活率會(huì)隨著染毒劑量的升高而呈下降趨勢，并且通過比較兩種顆粒物質(zhì)的IC值，炭黑的IC(16 μg/mL)小于塵土的 IC(110 μg/mL)，說明炭黑對(duì)HUVECs 產(chǎn)生的毒性較大，而本次實(shí)驗(yàn)中使用的炭黑是納米級(jí)的顆粒物，塵土是微米級(jí)的顆粒物，這也從側(cè)面反映出顆粒物的尺寸越小，對(duì)細(xì)胞的毒性作用越大。也有學(xué)者通過對(duì)不同粒徑的二氧化硅對(duì)HUVECs損傷的比較，得出納米二氧化硅比微米二氧化硅的細(xì)胞毒性大的結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與之相符。對(duì)于重金屬鉛、砷、鎘對(duì)細(xì)胞毒性大小的研究，比較這三者的IC發(fā)現(xiàn)，鉛的細(xì)胞毒性是最小的，鎘的細(xì)胞毒性最大。

然而在以往的研究中，往往只關(guān)注于PM整體效應(yīng)或只針對(duì)某一種組分導(dǎo)致的效應(yīng)，缺乏對(duì)于PM中不同組分聯(lián)合作用的研究。毒理學(xué)上將兩種或兩種以上的化學(xué)物質(zhì)同時(shí)或先后作用于生物體引起的毒作用稱為聯(lián)合作用。聯(lián)合作用主要分為相加作用、獨(dú)立作用、協(xié)同作用和拮抗作用4 類。目前關(guān)于聯(lián)合作用的評(píng)價(jià)方法有許多，例如等效線圖法、聯(lián)合作用系數(shù)法等，但是在應(yīng)用過程會(huì)受到一定限制，因此有研究者開始用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究化學(xué)混合物的聯(lián)合毒性。其中，析因設(shè)計(jì)是一種多因素的交叉分組設(shè)計(jì)，要求將各個(gè)因素的水平進(jìn)行全面組合，這樣可以對(duì)各種組合的交互作用估計(jì)得較為準(zhǔn)確。最常用的兩因子或三因子析因設(shè)計(jì)。本研究采用2×2 析因設(shè)計(jì)對(duì)炭黑、塵土和鉛、砷、鎘的聯(lián)合作用進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，炭黑、塵土分別與重金屬聯(lián)合染毒時(shí)，細(xì)胞存活率顯著低于其單獨(dú)染毒時(shí)的細(xì)胞存活率；而且炭黑與亞砷酸鈉、炭黑與氯化鎘之間存在交互作用，具體表現(xiàn)為協(xié)同作用，即兩者的綜合效應(yīng)大于單個(gè)效應(yīng)的總和。同時(shí)，根據(jù)各組分在PM中的實(shí)際質(zhì)量占比按比例進(jìn)行染毒，發(fā)現(xiàn)炭黑與鉛、砷、鎘三者聯(lián)合染毒時(shí)及塵土與鉛、砷、鎘三者混合染毒時(shí)，細(xì)胞存活率顯著低于炭黑、塵土單獨(dú)染毒時(shí)的細(xì)胞存活率。

本研究對(duì)于炭黑、塵土與鉛、砷、鎘的聯(lián)合毒性作用做了初步的探索，發(fā)現(xiàn)PM中不同組分都可以對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，納米炭黑顆粒的細(xì)胞毒性作用比塵土顆粒大，鉛、砷、鎘對(duì)細(xì)胞的毒性作用大小為氯化鎘＞亞砷酸鈉＞醋酸鉛。炭黑、塵土分別與鉛、砷、鎘3 種金屬聯(lián)合染毒時(shí)比單獨(dú)染毒時(shí)細(xì)胞毒性更大，且炭黑與亞砷酸鈉、氯化鎘之間存在交互作用，具體表現(xiàn)為協(xié)同作用，但是塵土與3 種金屬的聯(lián)合暴露比炭黑與3 種金屬的聯(lián)合暴露細(xì)胞毒性更大。本研究結(jié)果提示，應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注炭黑來源的PM污染源對(duì)血管損傷及相關(guān)疾病的影響，尤其當(dāng)PM中砷、鎘與炭黑聯(lián)合暴露時(shí)，對(duì)血管內(nèi)皮損傷更加嚴(yán)重。